Involvement of cyclooxygenase-2 in tumor necrosis factor-related activation induced cytokine (TRANCE) : induced osteoclastogenesis

Abstract

RAW 264.7 세포에서 TRANCE 자극에 의한 파골세포 분화과정 중의 COX-2 의 작용 파골세포 (osteoclast) 는 우리 몸에서 유일하게 뼈를 분해하는 다핵세포(multinucleated cell)로 뼈를 생성하는 조골세포 (osteoblast)와 함께 뼈의 항상성 (homeostasis)을 유지한다. 파골세포는 TRANCE (tumor-necrosis factor related activation induced cytokine) 자극에 의해 그 전구체인 대식세포 (macrophage)로부터 분화한다. 이 분화 과정에 있어서 TRANCE 신호전달을 연구하던 중, small GTPase family 중의 하나인 Rac1 이 우세하게 발현하지 않는 세포 (RacDN) 에서 파골세포로의 분화가 일어나지 않는 것을 발견했다. Rac1이 파골세포분화 (osteoclastogenesis)에 있어 중요한 역할을 할 것이라 생각하여 분화과정에 있어 Rac1에 특이적으로 발현하는 유전자를 찾기 위해 PCR-select cDNA subtraction cloning을 수행하였다. 그 결과 27개의 유전자를 찾았고 그 중 cyclooygenase (COX) -2 에 흥미를 가지게 되었다. COX-2 는 northern hybridization 으로 확인한 결과 RacDN 세포에서 발현이 많이 감소하였고, 대식세포 RAW 264.7 에서는 TRANCE 자극에 대해 빨리 (2시간 내) 발현이 증가한 후 점차 감소하는 경향을 보였다. COX는 arachidonic acid로부터 prostaglandin E₂ (PGE₂) 를 대사시키는 효소로 크게 COX-1 과 COX-2 두 가지 타입이 존재한다. COX-1이 대부분의 세포에 일정하게 존재하는 반면 COX-2 는 다양한 cytokine 이나 mitogen 자극에 의해 발현이 유도된다. COX-2를 중요하게 생각한 이유는 COX에 의해 생성된 PGE₂가 파골세포로의 분화를 촉진하고 뼈의 분해를 증진시킨다는 보고가 있기 때문이다. PGE₂는 현재 조골세포에서 주로 생성된다고 알려져 있다. 이 논문에서 COX-2의 활성도를 보기 위해 세포 배지로 용출된 PGE₂의 양을 측정했는데 RacDN 세포는 용출된 PGE₂ 양이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한, MAPK 억제제를 전처리한 후 PGE₂ 양을 측정한 결과 p38 MAPK 억제제인 SB203580을 처리했을 때 COX-2 activity가 감소한 것으로 보아 COX-2 를 활성화시키는데 있어 p38 이 관여함을 알 수 있었다. COX-2 promoter 에 결합하여 유전자 발현을 조절하는 인자로 현재 NF-κB, NFAT, CREB, c/EBPβ가 밝혀져 있다. 파골세포 분화 시 TRANCE 자극 특이하게 작용하는 전사 조절인자를 찾기 위해 COX-2 promoter의 각 결합 부위를 순차적으로 없앤 mutant promoter를 이용하여 reporter assay을 시행한 결과 NF-κB 결합 부위가 없을 때 luciferase 값이 급격하게 감소하였다. COX-2 promoter에는 NF-κB 결합 부위가 두 부분이 있다. 전사 시작 부위로부터 먼 부위(-592 ;-564)와 가까운 부위(-368 ; -341)가 있는데, EMSA로 확인한 결과 NF-κB에 의해 COX-2 promoter 가 작동될 때는 먼 부위(-592 ;-564)가 관여하는 것으로 나타났다. 또한, MAPK 억제제들을 전처리한 후 EMSA를 수행한 결과 RAW 264.7 세포에서 TRANCE 자극에 의해 NF-κB, COX-2가 활성화 되는데 p38 MAPK 가 관여함을 알 수 있었다. 이렇게 작동된 COX-2 가 실제로 파골세포 분화에 어떻게 작용하는지 보기 위해 쥐의 골수로부터 얻은 대식 세포에 COX 억제제인 indomethacin 또는 COX-2 억제제인 celecoxib를 TRANCE와 동시에 처리하거나 TRANCE 자극 2일 후에 처리한 다음 4일 후에 파골세포 분화 표식자인 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)을 염색한 결과 indomethacin과 celecoxib 모두 TRANCE와 동시에 처리했을 때 억제제의 농도가 높아질수록 TRAP 염색이 되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이미 분화가 시작된 이후엔 파골 세포로 가는데 있어 COX-2의 역할이 크게 중요하지 않다. 즉, COX-2가 RAW 264.7 세포에서 TRANCE 자극에 의한 초기 파골 세포 분화에 아주 중요하게 작용한다는 것을 의미한다. 또한, celecoxib는 현재 면역억제제, 통증 완화제로 임상적으로 쓰이고 있는데, 만약 이 논문의 결과처럼 골다공증이 유발된 동물에서 파골 세포의 기능을 억제할 수 있다면, 골다공증 치료제로서 쓰일 수 있는 가능성이 있다. ; Osteoclasts(OCs) are multinucleated cells that resorb bone and are essential for maintaining bone homeostasis together with osteoblasts. Tumor necrosis factor - related activation induced cytokine (TRANCE) is the essential signal required both in vitro and in vivo for full osteoclast differentiation in the presence of the permissive factor macrophage colony-stimulating factor(M-CSF). While we investigate TRANCE signaling in osteoclastogenesis, we found that osteclast differentiation is not occurred in Rac1-dominant negative RAW 264.7 monocyte/macrophage cells. To identify Rac1-dependent genes that are specifically expressed during osteclastogenesis, I employed a PCR-select cDNA subtraction cloning. Here, I found that cyclooxygenase (COX)-2 is upregulated through Rac1-p38 MAPK signaling pathway upon TRANCE stimulation in RAW 264.7 cells. Here, I found that COX-2 mRNA and protein level and PGE_2 production in RAW 264.7 cells were significantly increased by TRANCE stimulation through Rac1-p38 MAP kinase-dependent pathway. By using transient transfection assays, I found that the -692/-564 region of the COX-2 promoter gene was critical for TRANCE-induced promoter activity. This TRANCE-responsive region contained a NF-KB site that, when mutated, completely abolished COX-2 promoter activation by TRANCE. Inhibition of COX-2 by celecoxib block differntiation of macrophages to TRAP-positive osteoclastic cells, suggesting TRANCE-induced COX-2 produces PGE2 which appears to be necessary, but not sufficient, for osteoclast differentiation. In conclusion, TRANCE stimulates COX-2 expression via Rac1, p38, NF-KB pathway in early stage and expressed COX-2 regulates osteoclast differentiation.