CYP1A1 유전자 발현 조절에 COX와 histone deacetylase의 영향

Abstract

본 논문에서는 효소 저해제를 이용하여 COX와 histone deacetylase가 TCDD에 의해 유도된 CYP1A1 유전자 발현 조절에 미치는 영향을 생쥐 간 및 세포 배양 시스템을 이용하여 연구하였다. 연구 방법으로 CYP1A1 유전자 발현은 luciferase reporter gene 시스템을 이용하여 측정하였고, CYP1A1 효소 활성은 EROD 활성을 통해 관찰하였으며, CYP1A1 mRNA의 발현정도는 RT-PCR를 이용하여 확인하였다. C57BL/6 생쥐에 COX의 비선택적 저해제인 aspirin을 전처치 시 3MC에 의한 EROD 활성이 저해되었고, Hepa-I 세포와 MCF-7 세포에 aspirin, celecoxib, nimesulide 등의 COX 저해제를 전처치 시 TCDD에 의한 luciferase 활성과 EROD 활성이 저해되었다. Hepa-I 세포에 SB100, SB123, SB118, LVII-54, CY01 등의 curcumin 유도체를 전처치 시 TCDD에 의한 luciferase 활성과 EROD 활성은 저해되었고, 이상의 결과로부터 COX가 CYP1A1 유전자 조절에 관여하고 있음을 알 수 있다. Histone의 아세틸화는 유전자 발현 조절에 중요하여 본 논문에서는 histone deacetylation 저해제인 HC-Toxin을 사용하여 histone deacetylase가 CYP1A1 유전자 조절에 미치는 영향을 Hepa-I 세포와 MCF-7 세포에서 관찰하였다. Hepa-I 세포에 HC-Toxin을 단독 처치 시 luciferase 활성은 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였으나 EROD 활성은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 다양한 농도의 TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M)와 HC-Toxin (3×10^-8 M 10^-7 M 10^-6 M)을 병용처치 시 luciferase 활성과 EROD 활성은 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 Hepa-I 세포에서 HC-Toxin 단독 처치 시 Cyp1a1 mRNA 발현은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았으며, 다양한 농도의 TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M)와 HC-Toxin (3×10^-8 M 10^-7 M 10^-6 M)을 병용처치 시 Cyp1a1 mRNA 발현은 TCDD와 병용처치 한 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였다. MCF-7 세포에 HC-Toxin 단독 처치 시 luciferase 활성은 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였으나 EROD 활성은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 다양한 농도의 TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M )와 HC-Toxin (3×10^-8 M 10^-7 M 10^-6 M)을 병용처치 시 luciferase 활성은 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였으나, EROD 활성은 3×10^-8 M HC-Toxin에서 최대 활성을 보였고 3×10^-8 M 이상의 농도에서는 그 활성이 감소하였다. 또한 MCF-7 세포에 HC-Toxin 단독 처치 시 CYP1A1 mRNA 발현은 대조군과 큰 차이가 없었고, 다양한 농도의 TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M)와 HC-Toxin (3×10^-8 M 10^-7 M 10^-6 M)을 병용처치 시 CYP1A1 mRNA 발현은 HC-Toxin 농도 의존적으로 증가하였다. Hepa-I 세포에서 HC-Toxin은 저산소 상태에서 저해되었던 TCDD에 의한 EROD 활성을 회복시켰다. 그리고 Hepa-I세포와 MCF-7 세포에서 nimesulide 전처치로 저해되었던 TCDD에 의한 EROD 활성도 HC-Toxin 처치 시 회복되었다. MCF-7 세포에서 HC-Toxin은 nimesulide 전처치로 저해되었던 TCDD에 의한 CYP1A1 유전자 발현을 회복시켰다. 위의 결과들에서 CYP1A1 유전자 발현 조절에 있어 COX와 histione deacetylase의 중요성을 확인할 수 있었고, 앞으로 이들의 작용 메카니즘에 관한 더 많은 연구가 필요하다. ; In this study, we tried to understand the role of COX and histone deacetylase on the regulation of CYP1A1 gene expression via using their inhibitors in vivo mouse liver and in vitro cell culture system. We observed the effect of non-specific COX-inhibitor, aspirin on 3MC-induced EROD activity in C57BL/6 mouse. EROD activity of mouse liver stimulated by 3MC was inhibited with the aspirin pretreatment. And we also evaluated the effect of COX-inhibitors, such as aspirin, celecoxib and nimesulide on CYP1A1 promoter activity and EROD activity in Hepa-I cells and MCF-7 cells. When COX-inhibitors were pretreated for 2 hrs or 6 hrs or 17hrs prior to TCDD treatment, TCDD stimulated EROD activity and CYP1A1 promoter activity were inhibited. And pretreatment of curcumin derivatives, such as SB100, SB123, SB118, LVII-54 and CY01 in Hepa-I cells inhibited TCDD stimulated EROD activity and Cyp1a1 promoter activity. COX-inhibitors and curcumin derivatives in Hepa-I cells and MCF-7 cells were not able to decrease CYP1A1 mRNA that was stimulated by TCDD. It is important to pretreat COX inhibitors for their activity to decrease the TCDD induced CYP1A1 gene expression. The acetylation and deacetylation of histone are important for gene expression. Thus, we investigated the role of histone deacetylase on CYP1A1 gene regulation by TCDD in Hepa-I cells and MCF-7 cells using histone deacetylase inhibitor, HC-Toxin. In Hepa-I cells, HC-Toxin alone increased the Cyp1a1 promoter activity but not EROD activity. Concomitant treatment of TCDD and HC-Toxin potentiated the effect of various concentrations of TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M) on Cyp1a1 promoter activity and on EROD activity in HC-Toxin dose dependent manner. HC-Toxin alone had no effect on Cyp1a1 mRNA level and potentiated the effect of various concentrations of TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M) on Cyp1a1 mRNA level in HC-Toxin dose dependent manner. In MCF-7 cells, HC-Toxin alone increased the CYP1A1 promoter activity but not EROD activity. Concomitant treatment of TCDD and HC-Toxin potentiated the effect of various concentrations of TCDD (10^-11 M, 10^-10 M, 10^-9 M) on CYP1A1 promoter activity in HC-Toxin dose dependent manner. Concomitant treatment of 3×10^-8 M HC-Toxin and TCDD resulted in a maximal increase on EROD activity and the higher concentrations than 3×10^-8 M HC-Toxin resulted lower EROD activity than the maximal stimulated state. HC-Toxin alone had no effect on CYP1A1 mRNA and potentiated the effect of various concentrations of TCDD on CYP1A1 mRNA expression. The effect of HC-Toxin on EROD activity and CYP1A1 mRNA stimulated by TCDD appears to be similar in MCF-7 cells. HC-Toxin recovered EROD activity inhibited by hypoxic condition in Hepa-I cells. And HC-Toxin also recovered or overstimulated EROD activity decreased by COX-inhibitors in Hepa-I cells and MCF-7 cells. These results suggest an important role of COX and histione acetylase in the action of TCDD on regulation of CYP1A1 gene expression.