Preliminary screening of caspase-12 mutants for the determination tetrapeptide specific for the activity of the caspase

Abstract

Aspartic acid만을 특이하게 인식하는 cystein protease인 caspase는 programmed cell death라고 명명되는 세포사멸 과정에서 꼭 필요로 한다. 알려진 14개의 caspase 중, caspase-12는 ER (endoplasmic reticulum)에서 일어나는 세포사멸 과정에서 발견되었고, amyloid-beta가 일으키는 세포사멸에 중요하다는 것이 알려져있다. 그러나 아직 caspase-12의 세포사멸 경로는 아직 자세하게 밝혀지지 않았다. 왜냐하면 현재까지 알려진 적절한inhibitor와 substrate없기 때문이다. Caspase는 스스로가 절단되어 활성화되는 특성이 있는데, caspase-12가 스스로 활성화 되기 위해 절단되는 부분은 ATAD이다. Caspase-12의 Large subunit 과 small subunit을 바꾸어 새롭게 재 조합한 reverse form의 subunit사이와 caspasre-8 의 substrate라고 알려진 Bid에 caspase-12의 절단 부분을 끼워 넣어 활성화된 caspase-12로 잘라보았지만 잘리지 않았다. 이는 염기배열의 차이로만 caspase의 substrate가 결정되지 않다는 것과 단순한 염기배열이 caspase의 가장 효과적인 substrate일 순 없을 것이라는 것을 설명할 수 있다. Substrate와 inhibitor를 합성하기 위해 caspase-12가 인식하여 절단하는 부분인 ATAD중 P₄, P₃, .P₂ (A, T, A)를 각각 하나씩 20의 amino acid로 변형시켰고, 활성화된 caspase-12로 이 변형 되진 caspase-12가 잘리는지 잘리지 않는지를 실험하였다. P₁ 부분은 대부분의caspase가 인식하는 부분 중에 aspartic acid로 강하게 고정되어 있는 부분이다. P₄ 부분에서는 cysteine을 제외한 19개의 amino acid중 glycine, histidine, lysine, praline, glutamic acid, serine, threonine, valine이 substrate로 대신 될 수 있다. 그리고 P₃ 부분에서는 proline을 제외한 18개의 amino acid가 모두 threonine을 대신할 수 있으며, 이에 반해 P₂ 부분은 단지 glycine 과 isoleucine만이 alanine을 대신할 수 있다. 이 결과를 바탕으로 sub-peptide library를 만들어 caspase-12의 substrate를 만들 것이다. ; Caspase, aspartic acid specific cystein protease, is essential for the most apoptotic cell death. Among 14 known caspases, caspase-12 was found to be involved in the endoplasmic reticulum-involved apoptosis. It is also known that the caspase is important in amyloid beta-induced apoptosis. Howerver, the study of caspase-12 signal tranduction pathway is largely unknown. This is mainly due to the unavailablity of synthetic inhibitor and substrate at the present time. The cleavage site of the caspase during autoactivation is ATAD. The insertion of the residues into the cleavage site of an reverse form of caspase-12 and Bid, a substrate of caspase-8, did not make them cleavable by the caspase-12. This indicate that the sequence may not be the substrate in a different conformation or the sequence may not be the most effective substrate for the caspase. To synthesize the substrate and inhibitor, I made mutant proteins of caspase-12 that is the only substrate of the caspase and examined whether they are cleavable by purified and active caspase-12. The P1 site is D invariably in the known caspase. For the P4 site among 19 amino acids (except Cys), Gly, His, Lys, Pro, Glu, Ser, Thr, Val works as substrates. For the P3 site, 18 amino acid expect Pro works and only Gly, Ile did for the P2. From the result, sub-peptide library will be prepared and finally, the substrate peptide will be determined.