PDGF에 의한 Hydrogen peroxide 생성체계에 대한 연구

Abstract

PDGFβ 수용체는 740, 751, 771, 1009, 1021의 tyrosine 잔기가 수용체 자체의 kinase 활성에 의해 자가인산화되고, 인산화된 tyrosine 잔기에 다양한 세포질 내 effector가 결합하게됨으로써 신호전달이 일어나게 된다. PDGF에 의한 H₂O₂ 생성 시 이런 effector들의 역할을 다양한 PDGFβ 수용체의 돌연 변이가 발현되어 있는 HepG2 세포주에서 조사하였다. HepG2 세포주들에는 정상 PDGFβ 수용체를 포함하여 Lys^(634)를 Arg으로 치환하여 kinase 활성을 없앤 kinase(-) 돌연변이 수용체, PI3K(Tyr^(740), Tyr^(751)), GAP(Tyr^(771)), SHP-2(Tyr^(1009)), PLC-γ1(Tyr^(l021))의 결합 부위로 작용하는 tyrosine 잔기(Y)들을 여러 가지 조합으로 phenylalanine 잔기(F)로 치환한 돌연변이 수용체들이 각기 발현되어있다. 이들 세포주들을 이용하여 PDGF에 의한 H₂O₂ 생성을 confocal microscope로 관찰하였다. 그 결과 PI3K만 결합할 수 있는 수용체가 발현된 경우에도 충분히 PDGF에 의해 H₂O₂가 생성되었다. PI3K가 결합하지 않거나, kinase 활성이 없는 돌연변이에서도 H₂O₂ 생성은 관찰되지 않았다. 정상 수용체나 PI3K만 결합할 수 있는 수용체가 발현된 HepG2 세포에서 PI3K의 선택적 저해제인 LY294002나 dominant negative mutant Nl7Rac1의 과잉발현에 의해 PDGF에 의한 H₂O₂ 생성이 억제되었다. 또한 PI3K만 결합할 수 있는 수용체가 발현된 HepG2 세포에서 guanine nucleotide exchange factor(GEF)인 βPix의 과잉발현에 의해 항상 H₂O₂ 생성이 증가하였으며, 이러한 증가는 PDGF에 의해 그 생성이 더욱 증가하였다. 이러한 결과는 HepG2 세포에서 PDGF에 의한 H₂O₂ 생성 시 수용체를 통한 PI3K의 활성화가 필수적이며, βPix를 통 한 Rac의 활성에 의해 PI3K와 H₂O₂ 생성체계간의 신호전달이 매개된다는 사실을 제시한다. ; Autophosphorylation of the PDGF receptor triggers intracellular signaling cascades as a result of recruitment of SH2 domain-containing enzymes, including phosphatidyhnositol 3-kinase(PI3-kinase), the GTPase-activating protein of Ras(GAP), the protein tyrosine phosphatase SHP-2, and phospholipase C-Υ1(PLC-Υ1), to specific phosphotyrosine residues. The roles of these various effectors in PDGF-induced generation of H₂O₂ have now been investigated in HepG2 cells expressing various PDGF receptor mutants. These mutants included required a kinase-deficient receptor and receptors in which various combination of the tyrosine residues required for the binding of PI3K(Tyr^740 and Tyr^751). GAP(Tyr^77l), SHP-2(Tyr^1009), or PLC-Υ1(Tyr^1021) were mutated to Phe. Only the PI3K binding site was alone sufficient for PDGF-induced H₂O₂ production. The effect of PDGF on H₂O₂ generation in cells expressing the wild-type receptor or the receptor containing only the PI3K binding site was blocked by the PI3K inhibitor LY294002 or by overexpression of a dominant negative mutant of Racl. The activation of Racl in PDGF-induced H₂O₂ production was stimulated by the βPix, Rac-specific guanine nucleotide exchange factor(GEF). These results suggest that a product of PI3K is required for PDGF-induced production of H₂O₂in non-phagocytic cells, and that Racl mediates signaling between the PI3K product and the putative NADPH oxidase by βPix.