Baculovirus/곤충세포 발현체계를 이용한 tissue inhibitor of metalloproteinase-1의 발현과 기능 부위분석에 관한 연구

Abstract

Matrix metalloproteinase (MMP) 효소군은 활성부위에 아연을 요구하는 metalloproteinase 일종으로, 정상적인 발생과정과 혈관생성에 필요한 세포간질의 분해에 관여한다. 세포간질의 분해는 관절염, 골다공증과 치막염 등의 만성 염증성 질환과도 연관성이 있고, 기저막을 뚫고 순환계를 거쳐야 하는 암의 전이에 전제 조건이므로 세포간질을 파괴하는 MMP효소군은 생체 내에서 이의 여러 질병의 발병이나 임의 전이에 깊이 관여한다. 생체내 MMP활성은 tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMPs)라는 단백질에 으해 조절되며, 생체내에서 MMP와 TIMP의 평형이 깨지면 관절염, 골다공증, 암의 성장 그리고 암의 전이와 같은 질병을 일으킨다. 이러한 생체내 중요성을 지닌 MMP와 TIMP간의 상호작용에 대한 정확한 기능부위와 정보는 아직 제한적이다. 본 연구에서는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-9등의 MMP효소들과 결합하여 생체내 활성을 억제하는 TIMP-1단백질의 기능부위를 규명하고자 TIMP-1 단백질의 두 번째 아미노산인 Thr²을 alanine (Ala), histidine (His), leucine (Leu), phenylalanine (Phe)으로 치환한 돌연변이를 제조하고 그 돌연변이에 의한 MMP 활성억제능을 조사하였다. Thr²위치는 3차원 구조분석을 통해 억제능에 중요하다고 이미 알려진 N-terminal 부위 중에서 특히 MMp-3의 catalytic domain의 active site cleft인 S1 pocket안에 상호작용을 하는 중요한 부위로 알려져 있으므로 이 부위를 Thr의 side chain과 성질이 서로 다른 여러 아미노산으로 치환시켜 wild type TIMP-1의 활성억제능과 비교하였다. 이를 이해 wild type TIMP-1 와 Thr²를 각각 Ala, His, Leu과 Phe으로 치환한 TIMJP-1 돌연변이들 및 MMP-9을 baculovirus 발현체계를 이용하여 발현시켰고, 이 단백질들이 발현된 곤충세포에서 DNA를 분리정제한 뒤 PCR을 통해 DNA 수준에서 확인하고, wild type TIMP-1 및 돌연변이들은 westem blot analysis를 통해 단백질 수준에서 확인하였다. 그리고 MMP-9은 Zymography로 단백질 발현 및 그 기능성을 확인하였다. 배지상으로 분비된 wild type TIMP-1 및 mutant TIMP-1 단백질 시료를 antigen competition assay법으로 정량한 뒤, E.coli에서 발현시켜 insoluble inclusion body로 얻은 후 refolding하여 활성화시킨 MMP-3 catalytic domain을 활성 억제능 비교 실험에 이용하였다. 실험결과 Ala 과 His 돌연변이는 MMP-3 catalytic domain의 형광성 펩티드 분해능을 거의 억제하지 못하였고, Leu, Phe 돌연변이는 wild type TIMP-1의 약 50% 정도의 억제능을 보였다. TIMP-1의 Thr²부위가 MMP들에 대한 선택적 작용에도 관여하는지 알아보고자 본 연구에서 발현시켜 부분 정제한 MMP-9에 대한 활성 억제능도 조사하였으나 발현된 MMP-9이 분해되어 wild type TIMP-1에 의해서도 활성이 억제되지 않았으므로 좀더 대량으로 발현시켜 proform만 분리정제하여 사용할 필요가 있다고 사료된다. 이상의 연구 결과들로부터 TIMP-1 단백질의 Thr²부위의 β-methyl group의 hydrophobicity가 MMP-3 catalytic domain의 active site cleft인 S1 pocket과의 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다. ; Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) regulate matrix metalloproteinases (MMPs) that are required for the degradation of extra cellular matrix components during normal embryo development, morph genesis, and wound healing. Disruption of this balance result in disease such as arthritis, arteriosclerosis, tumor growth, and metastasis, but inhibitors mechanisms of TIMPs are not fully clarified. Recently N-terminal domain has shown to be responsible for the inhibitory action against active MMPs. Especially a second amino acid, threonine (Thr²) of secreted TIMPI might be very important because it extends into the specific pocket of each MMPs. In this study we generated several TIMP1 mutants in whom A Thr²residue was substituted to alanine (Ala), leonine (Leu), phenylalanine (Phe), or histamine (His) to examine whether the Thr²in TIMPI is a determinant for its inhibitors activity. Wild type TIMPI its mutants were expressed in baculovirus/insect cell system. Expression of relevant DNAs was confirmed by polymerize chain reaction analysis and the production of that recombinant secretary TIMPI proteins were confirmed by monoclonal anti TIMPI antibody from the cell culture media. We investigated interactions of TIMP mutants with stromelysin1 (MMP3) catalytic domain expressed in E. coli by using synthetic fluorogenic substrate peptide cleavage assay. The Ala and His mutants showed no inhibitory effect on fluormetric activity of the MMP-3 catalytic domain, but Leu and Phe mutants showed inhibitors action by about a half of that of wild type TIMPI. These results suggest that the hydrophobic of side chain of Thr²residue in wild type TIMP-1 is important for the interaction with S1 pocket of MMP-3 catalytic domain. We also expressed MMP-9 protein using baculovirus/insect cell system in order to investigate interaction between TIMPI mutants and MMPs and examine whether a specific amino acid substitution is able to increase its selectivity for a distinct MMP. However, MMP-9 protein expressed was secreted to the media in degradation forms and showed no interaction even with wild type TIMPI. The purification of active from of MMP-9 should be needed to further study the function if Thr²residue of TIMPI in interaction with MMP-9.