Sf9 곤충 세포에서의 G protein αq와 α11 subuint의 발현 및 Gα11, Gβ1γ과 무스카린성 수용체의 기능에 관한 연구

Abstract

Heterotrimeric guanine nucleotide binding protein들 (G proteins)은 세포 표면의 다양한 수용체로부터 adenylyl cyclase, phosphodiesterase, phospholipase와 ion channel 등과 같은 effector들로 신호를 전달하는데 필수적인 역할을 한다. G protein과 결합하는 G protein 관련 수용체 family에 속하는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (mAChR)는 여러 subtype으로 구분되며 각 subtype들은 G protein과 선택적으로 결합한다. 즉 홀수 group인 m1, m3, m5는 G α_q/11과 선택적으로 연결되고, m2, m4 group은 Gαi와 선택적으로 연결되어 신호를 전달한다. 하지만 최근 다른 G protein과의 결합이나 서로 다른 신호전달 체계 사이의 상호작용도 보고되고 있다. 본 연구의 목표는 무스카린성 수용체와 관련된 G protein subunit의 작용을 통해 서로 다른 수용체의 신호 전달 사이의 상호작용을 알아보는 것이다. 이를 위하여 본 실험실의 이전의 연구에서 Sf9 세포에 발현시켜 subtype 선택성 결합 특성을 나타내는 것으로 밝혀진 사람의 mAChR subtype인 Hm1과 Hm2 및 Hm3 수용체들과 동시에 발현시킬 수 있는 G protein들의 재조합 Virus들을 제조하고자 하였다. 본 연구에서는 그 중 홀수 group의 mAChR subtype의 주요 관련 G protein인 Gα_q와 Gα_11의 재조합 virus를 baculovirus/곤충 세포 체계를 이용해 제조하였고, Sf9 곤충세포에서의 Gα_q및 Gα_11의 발현을 PCR 분석과 Western blot 분석을 통해 DNA와 단백질 수준에서 확인하였다. 또한 발현이 확인된 Gα_11이 본 실험실에서 제조된 재조합 virus를 이용하여 발현이 확인된 Gβγ dimer와 결합해 trimer를 형성하고 활성화되면 서로 해리되는 것을 histidine-tagged Gγ와 Ni-NTA column을 사용해 확인하였다. 생성된 Gprotein의 재조합 virus를 이용하여 Sf9 세포에 mAChR와 동시 발현시켜 mAChR subtype의 신호전달 반응간의 cross-regulation에 대한 영향을 조사하기 위해 먼저 Sf9 세포내에 endogenous하게 존재하는 G protein 및 신호전달에 관여하는 체계들이 Sf9 세포에 다량 발현된 mAChR 활성화에 따라 나타내는 신호전달 기능을 조사하였다. Wild type Hm1, Hm2, Hm3와 Gα_i와 선택적으로 coupling한다고 알려진 부위를 Hm1이나 Hm3의 대응되는 아미노산으로 치환시킨 Hm2 mutant 수용체들 (Hm2 IL>LS, Hm2 VTIL>AALS) 각각이 발현된 Sf9 세포에서 각 수용체 활성화시에 나타내는 cAMP 반응을 분석한 결과 Hm2 활성화에 의해서는 cAMP 반응이 억제되었고 Hm2 VTIL> AALS의 경 우Hm2의 cAMP 억제 반응이 소실되었다. 따라서 발현시킨 mAChR subtype이 세포 내에서 G protein과 coupling하여 Sf9 세포 내 신호전달 체계를 이용해 정상적으로 기능을 수행함을 확인하였다. 또한 서로 다른 G protein을 경유하는 mAChR subtype 사이의 상호 작용을 알아보기 위해 PLC 억제제로 알려진 U73122를 사용하여 Hm2와/또는 Hm3 수용체를 발현시킨 Sf9 세포에 U73122를 처리하였을 때 Hm2의 활성화에 따른 cAMP 반응이 억제되어 나타나는 것을 관찰하여 PLC가 저해되면 m2 작용이 억제됨을 알 수 있었으며 이에 대한 자세한 세포 내 기전을 조사함으로서 mAChR subtype의 신호전달기능간의 상호 관계가 밝혀질 수 있으리라 사료된다. Sf9 세포에서 mAChR의 신호전달 반응에 대한 특정 G protein subunit의 조절을 조사하기 위해 Hml 수용체와 Gα_11, Gβ₁γ₁-HT, PLCβ₁을 조합하여 동시 발현 시켰을 때 Hm1에 의한 IP₃ 반응이 감소되어 나타남이 관찰되었다. 이러한 현상이 외부에서 발현시킨 G protein subunit의 기능에 의한 것인지 또는 여러 재조합 virus를 동시 감염시켜 나타나는 수용체 발현 감소에 의한 것인지를 조사하기 위해 mAChR의 길항제인 [³H]QNB를 사용해 수용체 결합 분석을 실시하여 Hm1 수용체가 세포막에 발현된 정도를 관찰한 결과 Hm1이 여러 재조합 단백질들과 함께 발현시발현율이 감소됨을 관찰하였다. Wild type baculovirus인 AcMNPV를 함께 감염시켜 수용체의 발현율을 조정하고자 하였으며, 앞으로 수용체의 발현이 동등한 조건에서 수용체와 G protein subunit 간의 작용을 알아보기 위한 연구가 계속될 필요가 있다. ; Heterotrimeric guanine nucleotide-binding proteins (G proteins) serve an essential role in cell physiology by transducing signals from a broad class of cell surface receptors to specifiec effector such as adenylyl cyclase, phosphodiesterase, phospholipase and ion channel. Muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) that belong to G protein coupled receptor superfamily have been classified into five subtypes and each subtype has been known to show the G protein coupling selectivity. The ml, m3, and m5 receptors preferentially couple to G_0/_11 class, whereas the m2 and m4 receptors are selectively linked to G_i/_0 family. However, recent studies have shown the cross-regulation between the different signaling pathways and the promiscuous G protein coupling. The overall purpose of our study is to assess the cross-talk between different muscarinic receptor signaling pathways through related G-protein subunits. For this purpose, recombinant viruses were prepared for G protein subunits which can be coexpressed in Sf9 cells with human mAChR subtypes, Hml, Hm2 and Hm3. In this study, recombinant viruses for G protein subunits, Gα_11 and Gα_q, especially coupled with odd group of mAChR subtypes, were produced. Expression of their relavant DNAs and proteins was confirmed by PCR and Western blot analyses. The heterotrimeric complex formation and separation of recombinant Gα_11 from recombinant Gβ_Υ dimer upon stimulation were confirmed using histidinetagged Υ subunit and Ni-NTA columns, partially indicating that functionally active G-protein subunits were expressed in Sf9 cells. In order to examine whether the mAChR subtypes expressed in Sf9 cells show the proper intracellular signaling function to couple with specific G protein subunit endogenously present in Sf9 cells, cAMP responses were analyzed in Sf9 cells expressing wild type Hml, Hm2, Hm3 or mutant Hm2 (Hm2 VTIL>AALS) in which amino acid residues responsible for Gα i-specific coupling were replaced with the corresponding amino acids from Hml or Hm3. Elevation and no change of forskolin-stimulated cAMP formation were observed in Hml- and Hm3-expressing cells, respectively. The cAMP formation was inhibited in cells expressing Hm2 but Hm2-mediated cAMP suppression was disappeared in cells expressing mutant Hm2, suggesting the different intracellular signaling responses of the three mAChR subtypes. To investigate the cross-regulation between signaling pathways of mAChR subtypes that couple to G_i or G_0/_11 protein, the effect of phospholipase C (PLC) inhibition on the Hml-mediated PI response and Hm2-mediated cAMP response in Sf9 cells expressing recombinant Hm2 alone or Hm2 and Hm3. PLC inhibition by U73122 produced the blockade of inhibition of cAMP formation by Hm2 activation. This result should be further pursued for its intracellular mechanisms (such as involvement of G protein subunit), which might explain partially for cross-regulation between different mAChR subtype-mediated PI and cAMP responses. When Hml and different combination of Gα_11, Gβ_1 and GΥ_1-HT were coexpressed in Sf9 cells to examine the regulation of signal transduction responses via mAChR activation by certain G protein subunit, marked reduction of Hml-mediated IP₃response was observed. To examine whether this reduced PI response is caused by inhibitory function of exogenously expressed G protein subunits or the reduced receptor expression by coinfection with several recombinant viruses, Hml expression level was examined by [³H]QNB-binding assay. The reduced Hml receptor number expressed in Sf9 cells was found to result from the coexpression of several recombinant proteins. Cross-regulation between mAChR and G protein subunits should be further investigated in the cells with equally controlled mAChR expression level.