Sf9세포에서 Gai2B1r1 단백질의 발현 및 Gaq 및 Gai2와 관련된 무스카린성 수용체 subtype Hm1와 Hm2의신호전달기능 분석

Abstract

무스카린성 아세틸콜린 수용체 (muscarinic acetylcholine receptor ; mAChR)는 외부의 자극에 의해 활성화되면 coupling되어 있는 G-protein을 통해 세포 내로 선호를 전달하는 G-protein coupled receptor이다. 이 수용체는 지금까지 잘 알려진 대로 신체의 말초 부교감 신경계 (peripheralparasympathetic nervous system) 및 중추 신경계에서 광범위한 신경 생리학적 작용 및 고차원적인 인식 기능과 관련되어 있다. mAChR는 현재 5개의subtype이 밝혀져 있으며, 각각의 subtype은 기능과 기질과의 결합 성질이 다르다고 알려져 있다. mAChR subtype 중 홀수 group인 수용체 m1, m3, m5는 pertussis toxin에 비의존적으로 G_0/_11 family와 연결되어 phosphoinositide(PI)의 분해를 촉진시킴으로써 이차 전달물질을 발생하여 세포 내 신호전달에 관여하며 짝수 group 수용체 m2와 m4는 pertussis toxin에 의존적으로 G_1/_0family와 coupling하여 cAMP 생성을 저해하고 Ca^++ 및 K^+-channel을 활성화하는 작용을 나타내므로써 신호전달에 관여한다. 본 논문에서는 m2 수용체와 coupling하는 Gi protein 중 Gα_i2, β_1,γ_1 및 His_6-γ_1 DNA를 포함하는 baculovirus transfer vector를 제조하고 이를 viralDNA와 함께 Sf9 곤충세포에 cotransfection시켜 각 G-protein subunit에 대한 재조합 virus들을 생성시켰다. 이들 재조합 virus를 이용하여 G proteinsubunit들의 Sf9 세포 내 발현을 DNA와 단백질 수준에서 확인하였고 Gα_i2, β_1 및 His_6-γ_1를 동시에 발현시킨 Sf9 세포에서 G protein의 trimer의 형성 및활성화 시에 trimer로부터 Gα_i2 및 β_1 His_6-γ_1 dimer로 분리되는 기능을 확인했다. Sf9 세포 내에 발현시킨 특정 mAChR subtype과 G-protein subunit간의 상호작용을 조사하기 위해 우선 사람의 mAChR subtype 중 hm1, hm2 및 hm3수용체가 발현된 곤충세포에서 수용체 활성화에 따른 세포 내 신호전달 기능을 조사하였다. PI 반응 및 cAMP 반응을 분석한 결과 수용체 활성화에 의해 Sf9세포에서 hm1와 hm3 수용체는 Gα_a/11을 경유한 PLC 활성화 작용을 나타내고hm2는 G α_i/o를 경유하여 adenylyl cyclase 억제 반응을 나타내는 것으로 추정되었다. 이러한 mAChR subtype의 선택적 신호전달 coupling이 특정 Gprotein subunit의 발현에 따라 조절될 수 있는지 조사하기 위해 Gi와 선택적으로 couple되어 있는 hm2 수용체와 Gα_11을 Sf9 세포에 동시에 발현시키고 수용체를 활성화시켜 PI 반응이 증가되는 것을 관찰하였다. 이 결과로부터 hm2수용체도 Gα_11의 발현정도가 증가되면 경유하여 PI 반응을 나타낼 수 있으며 hm2 수용체와 G protein간의 coupling의 변화로 cross-regulation이 일어났음이 추정되었다. 한편 hm1 수용체 활성화에 나타나는 PI 반응은 Gα_11β_1γ_1protein을 Sf9 세포에 동시 발현시켰을 때 크게 감소했지만 Gα_11의 발현을 늘림에 따라 PI 반응이 증가하는 양상을 보였는데 이는 Sf9 세포에 과발현시킨Gα_11의 단백질 발현이 증가할수록 hm1 수용체와의 coupling이 증가된다고 볼 수 있다. Gα_11β_1γ_1 protein을 hm1 수용체와 동시 발현시킴으로 hm1의 PI반응을 경유한 세포 내 신호전달 반응이 크게 감소하였는데 이러한 현상이 수용체 발현 감소에 의한 것인지 아니면 발현시킨 G protein subunit의 기능 때문인지를 조사하기 위하여 우선 수용체 결합 분석을 통해 수용체의 수를 측정한 결과 여러 virus들의 동시 발현이 수용체의 수를 감소시켜 세포 내 신호전달 반응을 감소시키는 원인임을 확인했다. 따라서 mAChR와 G-proteins의 상관관계를 규명하기 위해서는 wild type baculovirus인 Autogragha califomica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)를 control vector로 이용하거나 단독으로 발현시킨 수용체의 수를 낮게 조절함으로써 mAChR를 단독으로 감염시킬 때와 G-protein virus와 동시에 감염시킬 때의 발현된 수용체의 수가 일정하도록 조정 되어야 함을 알게 되었다. 따라서 AcMNPV로 G protein virus에 대한보정을 한 후 hm2 수용체 단독 또는 Gα_i2, Gβ_1γ_1 및 Gα_i2 β_1γ_1와 동시에 발현시킨 Sf9 세포에서 cAMP 반응을 분석한 결과 hm2 수용체에 의해 나타나는cAMP 억제 반응이 Gα_i2, Gβ_1γ_1와의 동시 발현으로 미미하게 감소하였고heterotrimer Gα_i2, Gβ_1γ_1 와 동시에 hm2 수용체를 발현한 경우에는 수용체 단독을 발현시킨 경우와 유사하게 수용체 활성에 의한 cAMP 억제 반응이 관찰되었다. 이를 통해 수용체와 동시에 발현시킨 G protein이 Sf9 세포에서 hm2 수용체의 작용에 크게 영향을 미치지 않는다고 추정할 수 있었으나 이는 반복실험을 통해서 결론지어야 하며 앞으로 발현시킨 수용체의 수를 조정하여 mAChR subtype과 G-protein subunit간의 상호작용에 대한 보강실험이 필요하다. ; Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) are G protein-coupled receptors which participate in an enormous variety of physiological functions in peripheral and central nervous system. They play important roles in higher cognitive processes such as memory and learning. Molecular cloning studies have revealed the existence of five mammalian muscarinic receptors (ml-m5) and individual subtypes have shown to differ in their functional and ligand-binding properties. Upon activation by agonists, the subtypes selectively activate distinct G-proteins ml, m3 and m5 stimulate PLC-β via pertussis toxin (PTX) insensitive G-proteins of G_o/_11, family. Whereas m2 and m4 receptors coupled to PTX sensitive G_i/_o proteins. However, recent studies have shown that receptors coupling predominantly to one G-protein family can also couple with other G-proteins, though less efficiently. In his study, to investigate corelation between mAChR subtype specific cellular signaling pathway and G protein subunits, G protein subunits (G α_i2, β₁, Υ₁, His_6 - Υ₁, His_6 - Υ₂) were expressed in Sf9 cells infected with each G protein subunit recombinant viruses. The expression of target G protein subunit was identified by PCR and Western blot analysis. G α_i2, β₁, Υ₁- His_6 proteins expressed in Sf9 cells were shown their abilities for formation of heterotrimeric complex and dissociation from heterotrimer into G α_i2 subunit and β₁Υ₁-His_6 dimer by G protein activator, AIF₄^-. The responses upon activation of the human muscarinic receptor subtypes, hml, hm2 and hm3 which highly expressed in Sf9 cells and were shown to possess their characteristic binding properties were tested for their functional coupling to PI hydrolysis and cAMP formation. Carbachol-induced IP₃ production was increased in Sf9 cells expressing hml and hm3 but in Sf9 cells expressing hm2 was weakly increased. Sf9 cells expressing hm2 showed inhibition of forskohn stimulated cAMP formation. Sf9 cells co-expressing with hm2 receptor and G α_11β₁r₁protein showed the carbachol-induced PI hydrolysis by hm2 receptor and this result suggested that cross regulation exist in mAChR subtypes co-expressed with G protein subunit. Expression level of hmAChR in Sf9 cells was decreased by co-expression with other proteins and decrease in hmAChR expression caused reduction of intracellular signaling by hmAChR. Therefore to study corelation between mAChR subtypes and G protien subunits, Sf9 cells expressing hmAChR alone need to modulate of mAChR density equal to co-expressed with other G-proteins by addition of wild type virus AcMNPV. After modulation of hmAChR density in Sf9 cells using AcMNPV, Effect of co-expression of hm2 receptor and G α_i2β₁r₁ on inhibition of forskoline stimulated cAMP formation were tested and the result showed that G αi2β₁r₁ overexpressed in Sf9 cells did not affect hm2 receptor activity.