Defensin-like protein encoding cysteine-rich peptides in immune response of Silkworm, Bombyx mori. (Lepidoptera)

Abstract

A defensin-like peptide has been identified in the lavae of a silkworm, Bombyx mori. It was found in a Bombyx EST database (SilkBase). A full size cDNA (determined by the wdS20658 cDNA) cloned and overexpressed in Escherichia coli cells in order to obtain a functional peptide with disulfide bridges. Sequence analysis revealed that peptide consists of 36 amino acid residues with six cysteines engaged in the formation of three intramolecular disulfide bridges. Sequence alignments indicate that the predicted peptides belong to the insect defensin family although phylogenetic analysis suggests they form a cluster distinct from that of other neopteran insect defensin. Semiquantitative RT-PCR analysis showed that defensin-like gene expression was inducible by bacterial injection. It is dramatically enhanced 8h after bacterial injection. This suggests that Bombyx defensin-like protein is respond to bacterial injection and is related with bacteria injection. We cloned the wdS20658 cDNA for the expression and reasonable yield of the fusion protein was obtained in Terrific Broth + 2% glucose medium. A recombinant Bombyx mori defensin-like protein was used to define the antimicrobial activity against bacteria and fungi. But it did not show direct antimicrobial activity against bacteria and fungi. From several analyses conducted in this study we could predict that a new peptide belonging to the defensin group based on its amino acid sequence but its predicted charge was anionic which is differ from cationic antibacterial insect defensins and neutral antifungal defensin-like peptides. Therefore Bombyx defensin-like peptide (GenBank DQ118523) is new group of insect defensin whish the function is still unknown.;누에가 속하는 Lepidoptera목의 곤충들에서 감염에 반응하여 생성되는 antibacterial peptide들이 몇몇 보고된 바 있다. 그 중에서도 antibacterial activity를 보이는 defensin이 속하는 cysteine-rich antimicrobial peptide들이 Diptera나 Coleoptera 심지어는 식물에서도 종종 발견되는 반면 Lepidotera에서는 매우 드물게 보고된 바 있다. 우리는 누에의 EST database인 SilkBase로부터 얻은 wdS20658 cDNA를 갖고 coning을 하고 recombinant protein을 발현시켰다. 이 peptide는 다른 defensin들과 마찬가지로 6개의 cysteine기를 갖고 있었으며 그 크기 또한 defensin과 유사하였다. Amino acid의 sequence alignment 결과 누에의 이 peptide는 다른 defensin들과 마찬가지로 고유한 위치에서 6개의 cysteine을 보이며 defensin family일 가능성이 높게 보였다. Phylogenetic analysis 결과 기존의 defensin들과는 또 다른 cluster를 이루는 것으로 보였다. RT-PCR 결과 누에의 defensin-like gene이 M.luteus 감염 이후 8시간까지는 증가하다가 그 이후로는 다시 감소하는 패턴을 보였다. 이는 이 defensin-like gene이 bacteria의 감염에 반응하여 나타나는 현상으로 bacteria의 감염에 있어 어떤 역할을 하는 것으로 보였다. Antimicrobial activity assay결과 bacteria나 fungi에 직접적인 anti-activity 보이지는 않았으나 앞서 실행한 sequence분석이나 RT-PCR의 결과로 미루어 보아 bacteria의 감염에 있어서 어떤 영향력을 미칠 것이라 추정할 수 있다. 일반적으로 antibacterial activity를 갖는 defensin이 cataionic인 반면 누에의 defensin-like petide는 anionic으로 예상되어 누에의 defensin-like peptide에는 기존의 defensin과 달리 아직 밝혀지지 않은 기능이 있을 것이라 예상된다.