p202 : a novel regulator ofosteoclast differentiation

Abstract

Bone resorption and remodeling is a controlled, physiological process that requires the function of osteoclasts. Signaling by Tumor necrosis factor (TNF) ― related activation induced cytokine (TRANCE) regulates differentiation of osteoclasts and is essential for the induction of osteoclastogenesis. During the course of our study to identify target genes induced by TRANCE in osteoclast precursor cells, I found IFN (interferon)-inducible p202 gene is up-regulated in the differentiated osteoclast using subtraction cloning. Interferon (IFN) is known as a negative regulation of osteoclastogenesis by unique signaling cross talks with TRANCE. I also show that IFNAR1-deficient bone marrow monocyte/macrophage cells (BMMs) fail to express p202 in response to TRANCE stimulation, suggesting that TRANCE induces p202 expression via Rac1-IFNβ-dependent pathway. Blockade of p202 expression by RNAi (RNA interference) increases osteoclast differentiation, suggesting that p202 is a negative regulator in osteoclastogenesis by TRANCE. p202 may represent a negative regulator for regulating bone homeostasis. I found that p202 binds chromodomain helicase DNA binding protein 3 (CHD3) using yeast two-hybrid, and CHD3 RNAi is inhibits the osteoclast differentiation. These results suggest the possibility that p202 by TRANCE-inducible IFN-β gene binds the CHD3, thus regulates negatively osteoclastogenesis.;파골세포 (osteoclast)는 우리 몸에서 유일하게 뼈를 분해하는 다핵세포(multinucleated cell)로써 뼈를 생성하는 조골세포 (osteoblast)와 함께 뼈의 항상성 (homeostasis)를 유지한다. 이런 항상성이 유지되지 못한다면 여러 질병이 일어나게 된다. 따라서 파골세포 분화 (osteoclastogenesis)를 조절하는 물질에 대한 연구가 중요하다. 파골세포는 TRANCE (tumor-necrosis factor related activation induced cytokine) 자극에 의해 그 전구체인 대식세포 (macrophage)로부터 분화한다. 이 분화과정에 있어서 TRANCE 신호전달을 연구하던 중, small GTPase family 중의 하나인 Rac1이 우세하게 발현하지 않는 세포 (RacDN cells)에서 파골세포로의 분화가 일어나지 않는 것을 발견했다. 이를 통해 Rac1이 파골세포 분화에 있어서 중요한 역할을 할 것이라 생각하였고 분화과정에 있어서 Rac1에 특이적으로 발현하는 유전자를 찾기 위해 PCR-select cDNA subtraction cloning 을 수행하였다. 그 결과 19개의 유전자를 찾았고, 그 중에서 p202에 흥미를 가지게 되었다. p202는 IFN (interferon)으로 유도되어 세포증식과 분화에 관여하는 것으로 알려졌다. p202는 northern hybridization으로 확인한 결과, RacDN 세포에서 발현이 많이 감소하였고 대식세포 RAW264.7에서는 TRANCE 자극 후 초기에는 발현이 증가한 뒤에 후기에는 조금 감소하는 경향을 보였다. 이 실험을 통해 파골세포로의 분화에 관여하는 유전자중 하나가 p202라고 확인하였다. TRANCE 에 의해 IFN-β 유전자가 발현되고 이 IFN-β가 파골세포에 영향을 주어서, IFN-β에 의해 매개되는 유전자가 발현되어 다시 TRANCE 신호의 매개체인 c-Fos를 막는, TRANCE에 의한 파골세포분화의 음성 되먹이 기전 (negative-feedback mechanisms) 작용한다는 보고를 통해 p202 역시 이런 신호전달에 관여할 것이라고 생각하였다. 그래서 IFN receptor가 없는 세포에서 TRANCE를 처리하였을 경우 p202발현을 확인하였더니 p202가 나타나지 않았다. 또 luciferase assay를 통해서 파골세포 분화되었음을 알려주는 유전자인 TRAP을 보았더니 p202 농도가 증가함에 따라 TRAP이 발현되지 않았다. 결국 p202가 앞에서 보고된 신호전달에 관여함을 알 수 있었다. p202가 파골세포 분화를 억제한다는 사실을 다시 확인하기 위해 p202 유전자 발현억제 (RNA interference, RNA 간섭)방법을 이용하여 파골세포의 분화 유도여부를 확인하였다. 실험결과 p202가 파골세포의 분화 억제 인자 (negative regulator)임을 확인하였다. p202 는 또한 여러 전사인자 (transcription factor)와 결합하여 DNA와의 결합을 막음으로써 여러 유전자들을 조절한다고 알려졌다. 파골세포에서 분화과정에 작용할 때 다른 물질과 결합하는지 알아보기 위해 yeast two-hybrid 방법을 사용하였다. 이를 통해 2개의 물질을 찾았고 그 중에 CHD3라는 물질에 흥미를 갖게 되었다. CHD3는 염색질 응축에 관여하는 HDAC (histone deacetylase) 복합체의 주요한 거대분자인데, HDAC는 세포주기, 세포사멸, 세포분화 억제 등에 영향을 주는 단백질로 알려져 있다. CHD3가 파골세포 분화억제에 영향을 미치는지 알아보기 위해 유전자발현억제 방법을 사용하였다. 실험 결과 CHD3가 없음으로 인해 파골세포 분화가 억제되었다. 비록 좀 더 자세한 실험이 요구되지만, 이 실험을 통해 TRANCE 신호에 의해 유도된 IFN-β로 p202가 발현되어 파골세포 분화에 억제인자로서 관여하며, CHD3가 파골세포 분화를 촉진시키는 것을 이 p202가 CHD3와 결합하여 억제하는 것이라는 가설을 세울 수 있다.