녹용 성분인 lysophosphatidylcholine과 그 유도체들의 진균 병원성화에 대한 활성 연구

Abstract

병원성 이형 곰팡이인 Candida albicans는 숙주 세포에서 비병원성 형태인 효모형으로 상주하고 숙주의 면역체계가 약화될 경우 병원성 형태인 균사체로의 전환이 일어난다. 병원성 형태에서 acid protease 분비와 숙주 세포에 붙는 receptor 발현 등이 수반된다. 본 연구에서는 녹용이 균의 생장과 병원성 형태로의 전환에 미치는 영향과 chitin synthase에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 첫째, C albicans의 형태전환과 생장에 미치는 녹용의 영향을 보기 위해 녹용의 성분을 분석하며 각각의 성분을 이용하여 그 효과를 검사하였다. 녹용을 70% 농도의 ethan이로 추출해서 획득된 CN - Es fraction이 균사체형으로의 형태 전환을 저해한다는 선행보고에 따라 CN - Es fraction을 분리하여 가장 높은 균사체 억제 활성을 나타내는 최종 성분인 CN-Es-6s-Fs-d fraction을 얻었다. 이 성분은 균사체 형성을 99.6% 억제했다. 균사체 전환 억제 정도를 기존 항진균제인 amphotericin B, clotrimazole, fluconazole, ketoconazole과 비교한 결과 CN-Es-6s-Fs-d fraction은 기존 항진균제보다 균사체 억제 활성이 낮았다. 부가효과를 알아보기 위하여 amphotericin B와 CN-Es-6s-Fs-d fraction을 Minimum Hypha! Inhibitory Concentrations (MHICs) 보다 낮은 농도로 배지에 첨가하여 균사체 형성을 거의 100% 억제하는 것을 확인하였다. CN-Es-6s-Fs-d fraction을 구조분석 한 결과 lysophosphatidylcholine으로 밝혀 졌는데, 이것의 유사물질인 phosphatidy1choline과 sphingomyelin이 균사체 형성에 미치는 영향을 실험하였으나 균사체 형성을 억제시키지도 활성화시키지도 않았다. CN-Es-6s-Fs-d fraction의 균사체 형태 전환 억제 성분의 활성도 spectrum을 알아보기 위하여 병원성을 나타내는 Candida 속의 종들에서의 균사체 전환에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 결과 C. albicans와 가장 근연종인 C. tropicalis에서는 녹용성분이 균사체 형성을 저해하지 못하지만 C.albicans, C.krusei, C. parapsilosis에서는 균사체 형성을 저해하였다. CN-Es-6s-Fs-d fraction의 구조 분석 결과 밝혀진 1-srearoyl-2-lyso-sn-glycero- 3-phosphatidylcholine (이하 lysophosphatidylcholine으로 명명) 이 C.albicans의 균사체 전환에 마치는 영향을 CN-Es-6s-Fs-d fraction과 비교한 결과 비슷한 경향으로 균사체 형성을 저해하였고 lysophosphatidylcholine이 Candida 속의 다른 종들의 균사체로의 전환에 마치는 효과나 다른 종들의 성장률에 미치는 효과도 CN-Es-6s-Fs-d fraction과 동일하므로 CN-Es-6s-Fs-d fraction을 lysophosphatidylcholine이라 확인하였다. CN-Es-6s-Fs-dfraction의 구조 분석 과정에 서 합성된 유도체인 N-stearoyl-O-phosphocholI-ne-L-serine methyl ester (이하 CH] -1 ester로 명명)와 1-lyso-2-stearoyla-mino-2-deoxy-sn-glycero-3-phospatidylcholine from L-serine (이하 CH]-1으로 명명)은 C. albicans에서 3.5μM,7μM에서 각각 균사체로의 전환을 저해하였으나 각각의 농도에서 효모형으로의 성장에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이 유도체들이 Candida 속의 여러 종들의 균사체 전환에 미치는 영향을 조사한 결과 lysophosphatidylcholine과 동일한 결과를 나타내었다. 둘째, 병원성 곰팡이에 의한 감염 치료에 도움을 줄 수 있는 또 다른 screening system으로, chitin synthase 1 activity에 대한 저해도를 조사하였다. 균사체 형성을 저해하는 CN-Es-6s-Fs-d fraction과 동일한 물질로 판명된 lysophosphatidylcholine은 chitin synthase 1의 활성을 억제하지 않고 그 유도체들인 CH] -1 ester와 CH] -1도 chitin synthase 1의 활성을 억제하지 않았다. 따라서 녹용의 정제 단계에서 획득된 여타 성분들 중에서 chitin synthase 1의 활성을 억제하는 성분을 찾을 수 있었는데, CN-Es-6s-As-gsfraction이 가장 높은 chitin synthase 1의 활성 억제를 보여주는 것으로 판명되었다.;Gradual increase of fungal infections in last two decades has been caused by the increment of immunocompromised patients because of wide spred of AIDS and the abuse of antibiotics in cancer chemotherapy and organ transplantation. In most cases, Candida was the major cause. Candida albicans is an opportunistic pathogen to be responsible for the candidiasis by invading the epitherial cells with hyphae which is widely believed pathogenic form. But it is keeping a yeast form as a normal flora in host cell. Previously it was reported that the hyphal transition suppressing activity of the deer antler extracts. Herein, we report biological activity of the fraction acquired from the deer antler extract as a hyphal transition and chitin synthase 1 activity suppressing agent against Candida species. CN-Es-6s-Fs-d fraction finally fractionated from the 70% ethanol extract of the deer antler(Cervus nippon) inhibited the hyphal transition 99.6%. This fraction suppressed the hyphal transition in a dose dependent manner. But CN-Es-6s-Fs-d fraction didn't affect the yeast growth at the concentration which completely suppressed the hyphal transition. Compared to other antifungal agents, this fraction showed lower activity in terms of suppression, however represented the additive effect in hyphal transition with amphotericin B. Structural analogues of CN-Es-6s-Fs-d fractions, sphingomyeline and phosphatidylcholine, didn't affect the hyphal transition in C. albicans. Spectrum analysis of CN-Es-6s-Fs-d fraction showed the same effects on the hyphal transition in C. albicans, C, parapsilosis, C. krusei but not that of in C. tropicalis. By structural analysis, CN-Es-6s-Fs-d fraction turned out as lysophosphatidylcholine. To repeat the same experiments with lysophosphatidylcholine gave us same results. This confirmed CN-Es-6s-Fs-d fraction is lysophosphatidylcholine. CHJ-1 and CHJ-1 ester, derivatives of the lysophosphatidylcholine, suppressed the hyphal transition. Their Minimal Hyphal Inhibitory Concentrations(MHICs) was 7 μ M and 3.5 μ M respectively. Lysophosphatidylcholine , CHJ-1, and CHJ-1 ester however didn't affect the yeast growth at concentration which completely suppressed the hyphal transition. Lysophosphatidylcholine, CHJ-1, and CHJ-1 ester suppressed the hyphal transition in C. parapsilosis, C. krusei at the concentration which suppressed hyphal transition in C. albicans but not C. tropicalis. The antifungal activities of deer antler extract were previously reported to selectively inhibited chitin synthase 1 in C. albiazns. However, lysophosphatidylcholine, CHJ-1, and CHJ-1 ester didn't inhibit the chitin synthase 1 activity. Other fraction of deer antler extract identified the activity to inhibit the chitin synthase 1 activity in C. albicans. Further structural analysis will identify the molecule to inhibit the chitin synthase 1 activity.