맥아(麥芽) 분획의 Quinone Reductase 유도활성 연구 및 Stilbene 유도체의 암세포 성장억제에 관한 연구

Abstract

암을 정복하려는 인류의 노력으로 지난 수십년간 수많은 화학요법제, 수술요법, 방사선 요법 등의 암치료법이 개발되었지만, 인구의 노령화와 산업사회의 발달로 인한 환경파괴, 오염물질의 증가로 인해 암의 발생률과 사망률은 계속하여 증가하고 있다. 따라서 화학적 암예방 (cancer chemoprevention)이 보다 경제적이고 효율적으로 암을 정복할 수 있는 새로운 접근방법으로 여겨지게 되었다. 암예방제는 암발생과정중 촉진기 (promotion)와 진행기 (progression)를 차단 혹은 억제하여 그 효과를 나타내는데, 촉진기와 진행기를 차단하는 데는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 을 제거하거나 polyamine 류의 합성을 억제하거나 항염증과 관련된 효소들 (cyclooxygenase-2, inducible nitric oxide synthase)을 억제하거나 세포자가사멸 (apoptosis) 를 유발하는 생화학적 기전들이 있다. 본 연구에서는 세포내의 제 2상 대사효소중 obligate two electrons reduction 을 매개하는 quinone reductase (QR) 의 활성이 증가할 경우, quinoids 화합물들의 대사과정에서 제 1상 대사효소인 cytochrome P450 에 의해 활성산소종이 발생되는 과정이 경쟁적으로 차단되므로 이로 인한 DNA, 단백질, 세포막 손상이 억제되어 궁극적으로 암이 예방된다는 가설에 따라 약 200여종의 천연물과 수종의 화합물에 대해 mouse Hepa 1c1c7 세포주를 배양하여 quinone reductase 유도능을 in vitro 에서 측정하였다. 그 결과 맥아 (Hordeum vulgare), 목별자 (Momordica cochinchinensis), 보두(Strychnos ignatii), 어성초 (Houttuinia cordata), 영신초 (Polygala japonica) 등에서 CD value 15 ~ 50 mg/ml 의 활성을 나타냈으며 이중 맥아 (CD = 36.8 mg/ml), 어 성초 (CD = 20. 6 mg/ml), 영신초 (CD = 17.3 mg/ml ) 에서는 높은 QR 유도활성을 나타냈다. 따라서 가장 높은 QR 유도활성을 나타낸 맥아, 어성초, 영신초에 대해 용매 분획화를 실시하였으며 그 결과 맥아의 methylene chloride 분획에서 세포독성은 나타나지 않으면서 높은 활성이 나타남을 확인할 수 있었다 (CD = 6.4 mg/ml). 이러한 활성의 증가는 QR 의 mRNA 를 RT-PCR 을 통하여 확인한 결과 QR 의 세포내 발현이 유전자 수준에서 조절되어 증가되었기 때문임을 알 수 있었다. 맥아는 옛부터 전통식음료와 음식의 당화에 이용되어 온 생약재로 암예방제로의 개발가능성이 매우 높으며 한방이나 기존의 연구에서 QR의 활성을 증가시켜 암을 예방한다는 보고가 이루어지지 않아 그 개발가치가 매우 크다하겠다. 세포자가사멸 (apoptosis) 은 암예방과 암치료의 두가지 측면에서 그 의미가 큰 세포사멸기전으로 개체의 발달 및 항상성 유지과정에 이용되고 있다. Apoptosis 유도물질은 암세포의 세포자가사멸을 유도함으로써 항암의 효과를 나타내는 한편, 정상개체에서 외부자극이나 활성산소종 등에 의해 변형된 세포의 자가사멸을 유도하여 항상성을 유지하게 함으로써 암예방의 효과를 나타낸다. 따라서 apoptosis 를 유도하는 물질의 검색과 그 기전에 대한 연구가 매우 활발히 이루어져 왔다. 포도껍질, 콩과식물의 뿌리, 뽕나무의 열매 등에 함유되어 있으며 항산화, 항염증, apoptosis 유도의 효능을 지닌 것으로 알려진 resveratrol (3,5,4′-trihydroxy-trans-stilbene)은 고농도 (20 ~ 100 mM)에서 apoptosis 및 cell cycle arrest를 야기하는 것으로 보고되었다. 따라서 본 실험에서는 resveratrol 유도체를 합성하여 그 활성을 측정하던 중 화합물 1 (3,4,5-trimethoxy-4′-bromo-cis-stilbene)이 sulforhodamine B법(SRB)으로 세포독성을 측정하였을 때, 이의 입체이성체인 화합물 2 (3,4,5-trimethoxy-4′-bromo-trans-stilbene)에 비해 매우 큰 독성 (A549, Col2 , IC_50 = 0.01 mg/ml) 을 나타내는 것을 확인하고 이에 대한 세포독성 기전을 수행하여, 화합물 1 이 cytostatic 한 기전보다는 cytotoxic 한 기전에 의해 세포독성을 나타내며 그 기전은 G₂M phase arrest를 거쳐 나타나는 apoptosis 에 의한 것이라는 사실을 colony formation efficacy test 및 flow cytometer 를 이용한 세포주기 분석을 통하여 알아냈다. 이미 resveratrol 및 그 유도체들의 세포독성 및 cell cycle arrest 에 p53가 관여한다는 보고에 따라 화합물 1 이 human colon 및 lung can cer cell lines (Col 2, A549) 에서 p53의 발현을 유도하는 지의 여부를 western blotting을 통해 확인하였으며 그 결과 Col 2세포에서는 대조군의 p53 발현정도가 워낙 높아 그 차이를 확인할 수 없었지만 A549 세포에서는 대조군에 비하여 p53의 발현이 뚜렷하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 화합물 1의 세포독성기전은 p53 에 의해 매개되는 G₂M phase arrest 및 apoptosis 임을 알수 있다. 1991 년 Cushman은 화합물 1의 강력한 세포독성효과에 대해 언급한 바 있으나 그의 세포독성기전에 대한 연구는 아직까지 이루어지지 않았다. 따라서 이번 화합물 1의 세포독성기전 연구는 화합물 1의 암치료제 및 암예방제로의 개발가능성을 열어준 가치있는 결과로 앞으로 이에 대한 활발한 연구가 수행될 것으로 여겨진다.;NAD(P)H:quinone reductase (QR), known as DT-diaphorase, is a kind of detoxifying phase II metabolic enzyme catalyzing hydroquinone formation by two electron reduction pathway from quinone type compounds, and thus facilitating excretion of quinoids from human body. With the usefulness of QR induction activity assay system for the modulation of toxicants, in the course of searching for cancer chemopreventive agents from natural products, the methanolic extracts of approximately two hundreds of oriental medicines were primarily evaluated using the induction potential of quinone reductase (QR) activity in cultured murine Hepa1c1c7 cells. As a result, several extracts including Hordeum vulgare, Momordica cochinchinensis, Strychnos ignatii, Houttuynia cordata, and Polygala japonica were found to significantly induce QR activity. In addition, the methylene chloride fraction of H. vulgare , one major dietary food source, showed potent induction of QR activity (CD=6.4 μg/ml) and increased QR gene expression. Furt her study for isolation of active principles from these lead extracts is warranted for the discovery of novel cancer chemopreventive agents. Based on the potential of resveratrol as amodulator of carcinogenesis by inhibiting metastasis or inducing apoptosis in cancer cells, several stilbene analogs were evaluated for cytotoxic activity in cultured human cancer cells. 3,4,5-Trimethoxy-4'-bromo-cis-stilbene (compound 1) was shown to be active. Prompted by the strong cytotoxic activity of compound 1 compared to its trans isomer and resveratrol, the action mechanism study were performed in human lung and colon cancer cell lines (A549, Col 2). Compound 1 induced accumulation in the Sub-G0 and G₂M phase DNA contents of the cell cycle by time- and dose-dependent manner and increased p53 expression in A549. Colony forming efficacy test and morphological changes were also consistent with the apoptotic phenomena. This results indicated that compound 1 induced p53-mediated apoptosis and G₂M phase arrest in A549. Accordingly, compound 1 can be a candidate for development of potential cancer chemopreventive or cancer therapeutic agent.