Protective role of sulfiredoxin in mouse embryonic fibroblast cells exposed to low steady-state levels of H2O2

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) are potent inducers of oxidative damage which consequently cause molecular damage and, over time, cell and tissue dysfunction, ultimately increasing the risk of disease. An imbalanced ratio between ROS production and elimination may disturb physiological signal transduction. Therefore, the tight regulation of ROS is critical for many biological processes. In mammalian system, H2O2 is removed mostly by catalase, glutathione peroxidase (Gpx), and peroxiredoxin (Prx). Prx is a family of peroxidases and shows slow-reaction rate compared with catalase and Gpx. However, given that 2-Cys Prxs (PrxⅠ~Ⅳ) exhibit higher affinity toward H2O2 and are very abundant in most cells, they can be efficient in removing lower levels of H2O2. Furthermore, the active site cysteine residue of 2-Cys Prxs is hyperoxidized to cysteine sulfinic acid (Cys-SO2) during catalysis with concomitant loss of peroxidase activity. Reactivation of the hyperoxidized Prx is catalyzed by sulfiredoxin (Srx). I therefore hypothesized that in the presence of low steady-state levels of H2O2 (~10 to 20 μM), Srx may play a critical role in maintaining the H2O2 eliminating capacity of cells through the restoration of the peroxidase activity of 2-Cys Prxs. To examine the protective role of Srx in cells exposed to low steady-state levels of H2O2, the embryonic fibroblast cells obtained from Srx+/- mice (Srx+/+ and Srx-/- MEF cells) were incubated in the presence of glucose oxidase (GOX), which catalytically produces H2O2. Because the H2O2 eliminating capacity of Srx-/- MEF cells was reduced and then H2O2 was contiuously accumulated in the medium, the intracellular ROS level in Srx-/- MEF cells is higher than Srx+/+ MEF cells in the same condition which exposed to low steady-state H2O2 level (10 to 20 uM). In accordance with this increase, the hyperoxidation of 2-Cys Prxs (I, II, and III) was markedly increased in Srx-/- MEF cells as compared to what was barely detectable in Srx+/+ MEF cells. Srx-/- MEF cells evidenced a dramatic apoptosis after GOX treatment. In contrast, there was merely detectable apoptosis in Srx+/+ MEF cells. Next, I carried out an‘add-back’ rescue experiment by adenoviral expression of Srx in Srx-/- MEF cells. Adenoviral expression of Srx converted Srx-/- MEF cells to be more resistant to accumulation of cellular ROS, hyperoxidation of 2-Cys Prxs, and apoptosis under low steady-state levels of H2O2. Collectively, these results indicate that Srx plays a crucial role in protecting cells from apoptosis under low steady-state levels of H2O2 via maintaining the H2O2-eliminating capacity of 2-Cys Prxs.;활성산소들은 그 양이 과다하면, 생체 구성 성분들에 대하여 분자 수준에서 손상을 가하기 시작하여 세포 및 조직의 사멸 및 기능장애를 초래하며, 결과적으로 질병을 유발하게 된다. 활성산소의 생성작용과 소멸작용 사이의 균형이 깨지게 되면, 생체 신호전달 과정에 심각한 이상을 초래하게 된다. 따라서, 이러한 활성산소들이 과도한 양으로 증가되지 않도록 조절하는 것은 정상적인 생체반응을 유지하는데 중요한 작용들 중의 하나이다. 포유동물에는 H2O2를 제거하는 효소로 catalase, glutathione peroxidase (Gpx), peroxiredoxin (Prx)가 있다. 그 중에서 Prx는 I~VI까지 6개의 isoform이 규명되었고, 이 Prx는 활성부위의 cysteine 수에 따라 2-Cys, atypical 2-Cys, 1-Cys로 나뉜다. 특히 2-Cys Prx들 (Prx I~IV)은 다른 peroxidase인 catalase나 Gpx에 비해, 기질인 H2O2와의 결합력이 매우 높고 세포 내에 다량으로 발현되어 그 함량이 매우 높기 때문에, 생체에 존재하는 저농도의 H2O2를 catalase나 Gpx에 비하여 매우 효율적으로 제거할 수 있다. 한편, 2-Cys Prx 효소들의 활성부위에 있는 cysteine thiol (Cys-SH)은 효소반응이 진행되는 동안 일부가 sulfinic acid (Cys-SO2)로 과산화되어 peroxidase 활성을 잃게 되는데, sulfiredoxin (Srx)는 이렇게 과산화되어 활성을 잃은 Prx들을 다시 활성화시키는 중요한 기능을 담당하는 효소이다. Srx에 의한 2-Cys Prx들의 재활성화 및 이와 관련된 산화적 손상 억제 작용에 관한 이전의 연구들은 100 μM 이상의 H2O2에 세포를 단 1회 노출시키는 조건에서 수행되어 저농도의 H2O2에 지속적으로 노출되는 상황들이 반영되지는 않았다. 따라서, 본 연구를 통하여 세포가 저농도의 H2O2 (약 10~20 μM)에 장기간 지속적으로 노출될 때에도, Srx는 2-Cys Prx들의 peroxidase 활성을 회복시키는 기능을 수행함으로써 세포의 사멸을 억제시키는 중요한 인자들 중의 하나로 작용한다는 것을 규명해 보았다. 이를 위하여 Srx가 정상적으로 발현되는 정상적인 마우스와 전혀 발현되지 않는 Srx-/- 마우스의 embryonic fibroblast 세포 (Srx-/- MEF 세포)에 glucose oxidase (GOX)를 처리하였다. GOX는 세포 배양 액 내의 β-D-glucose 산화를 촉진하여 D-gluconic acid 와 H2O2를 생성하기 때문에, 고농도의 H2O2에 세포를 단 1회 노출시키는 기존의 실험방법에 비하여 지속적으로 낮은 농도의 H2O2에 노출시켜 in vivo와 비슷한 조건을 조성할 수 있는 장점이 있다. 정상적인 MEF 세포들이 세포배양액에 존재하는 약 10~20 μM 범위의 H2O2에 지속적으로 노출되는 실험조건으로 GOX를 처리했을 때, 정상적인 MEF 세포와는 달리 Srx-/- MEF 세포는 H2O2 제거능이 현저히 저하되어 있어 배양액 내의 H2O2 농도는 시간이 경과할수록 지속적으로 증가되었고, 이에 따라 세포 내부의 활성산소 축적도 증가되었고, 2-Cys Prx들 (I~III)의 과산화도 크게 증가되었다. 결과적으로 정상세포에는 별다른 산화적 손상을 유발하지 않는 저농도의 H2O2에 Srx-/- MEF 세포가 지속적으로 노출되면, 산화적 손상작용들의 축적으로 인해 세포사멸이 증가되었다. 그리고, adenovirus를 이용하여 Srx-/- MEF 세포에 Srx를 다시 발현시켜주면, 이러한 세포 내 활성산소 축적과 이에 따른 2-Cys Prx들 (I~III)의 과산화, 그리고 세포사멸 등이 모두 억제되었다. 결론적으로 본 연구를 통하여 세포가 낮은 농도의 H2O2 (약 10~20 μM)에 장기간 지속적으로 노출될 때에도, Srx는 2-Cys Prx들의 peroxidase 활성을 회복시키는 기능을 수행함으로써 세포의 사멸을 억제시키는 중요한 인자들 중의 하나로 작용한다는 것이 규명되었다.