Label-Free DNA Aptasensor for Detection of Protective Antigen

Abstract

본 논문에서는 별도의 라벨링 과정 없이, PA (보호 항원, protective antigen) 와 결합함에 따라 구조가 변화하고, 이에 따라 형광의 세기나 전기화학적 신호가 변하는 aptasensor와 관련된 연구를 하였다. Part Ⅰ. 에서는 DNA에 별도의 라벨링 과정 없이 PA와 결합함에 따라 형광의 세기가 변하는 aptasensor를 연구하였다. 이 연구는 graphene oxide의 표면에 흡착된 PA 앱타머를 PA가 선택적으로 감지하는 것을 형광물질 oligreen을 사용하여 분석하였다. Oligreen은 DNA에 대해서만 결합하여 형광을 나타내는 물질로 PA와 DNA가 결합되면서, DNA가 graphene oxide표면에서 분리되어 형광이 증가하는 것을 통하여 PA와 DNA의 결합 정도를 알 수 있었다. PA의 선택성을 알아 보기 위해 다른 oligonucleotide와 PA를 반응시켰다. 또한, PA 앱타머와 BSA라는 다른 protein을 반응시켜 PA 앱타머가 PA에 대해서만 선택적으로 반응하고 그에 따라 구조적인 변화가 생긴다는 것을 증명할 수 있었다. Part Ⅱ. 에서는 DNA에 별도의 라벨링 과정 없이 PA와 결합함에 따라 전기화학적 신호가 변하는 aptasensor를 연구하였다. 이 연구는 graphene oxide의 표면에 흡착된 PA 앱타머가 PA를 선택적으로 감지하는 것을 전자전달 물질 Fe(5-Cl-Phen)32+를 사용하여 분석하였다. Fe(5-Cl-Phen)32+를 전자전달 물질로 사용하여 cyclic voltammetry를 측정한 결과 PA에 의해 PAA의 구조가 변화하면서 GO표면에 변화가 일어나 전기화학적 신호가 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 우리는 이러한 전기화학적 신호 변화를 이용하여 PA를 검출 할 수 있었다. PA의 선택성을 알아 보기 위해 다른 oligonucleotide와 PA를 반응시켰다. 또한, PA 앱타머와 BSA라는 다른 protein과 반응시켜 PA가 PA 앱타머에 대해서만 선택적으로 반응하고 그에 따라 구조적인 변화가 생긴다는 것을 증명할 수 있었다. Part Ⅲ. 에서는 전극표면에 흡착시킨 PA 앱타머가 PA와 반응하면 PA 앱타머의 구조가 변화하고, 이에 따라 전기화학적 신호가 변하는 것을 이용하여 PA를 검출하였다. 이 연구는 전극 표면에 흡착된 PA 앱타머를 PA가 선택적으로 감지하는 것을 전자전달 물질 Fe(CN)63-를 사용하여 분석하였다. Fe(CN)63-를 전자전달 물질로 사용하여 impedance를 측정한 결과 PA와 PA 앱타머의 결합으로 인하여 전극표면이 blocking되고, 이에 따라 전극의 표면 저항이 증가하게 되어 PA를 검출 할 수 있었다. cyclic voltammetry 역시 PA와 PA 앱타머의 결합으로 인하여 전극표면이 blocking되어 PA 앱타머의 산화환원전류 값이 감소하는 것을 볼 수 있었다. PA의 선택성을 알아 보기 위해 BSA라는 다른 protein을 반응시키는 control 실험을 통하여 PA가 PA 앱타머에 대해서만 선택적으로 반응하고 그에 따라 전기화학적인 신호가 변화한다는 것을 증명할 수 있었다.;This study used PA binding aptamer for selective and sensitive detection of PA, based on changes of fluorescence signal or electrochemical signal according to the change of the structure from the aptamer in the presence of PA. PA is the most extensively studied component of anthrax toxin. PA, which is the main component of the three-part protein toxin secreted by the Gram-positive Bacillus anthracis bacterium is the causative agent of the anthrax toxin. In Part Ⅰ, we have developed the method for the sensitive fluorescence detection of the Protective antigen, using the oligonucletide PAA and GO. GO-PAA titrated with PA at room temperature for 3 h using fluorescent OG. We found that the intensity of fluorescence increased by increasing the concentration of PA. The titration concentration of PA ranged from 0 to 40 nM. In PART Ⅱ, we have developed the method for the sensitive electrochemical detection of the PA, using the oligonucletide PAA and GO. GO-PAA titrated with PA at RT for 3 h using electron mediator Fe(5-Cl-Phen)32+. We found that the oxidative current increased by increasing the concentration of PA. The titration concentration of PA ranged from 0 to 300 nM. In PART Ⅲ, we have developed the method for the sensitive electrochemical detection of the PA, using the thiol modified oligonucletide PAA. SH-PAA titrated with PA at RT for 20 h using electron redox probe Fe(CN)63-. We found that the impedance increased by increasing the concentration of PA. The titration concentration of PA ranged from 0 to 4 μM.