Novel three-dimensional microfluidic cell culture systems for stem cell research

Abstract

Microfluidic cell culture systems are promising tools for cell biology study due to their ability to mimic and regulate cellular microenvironments by controlling chemical, physical and microenvironmental cues surrounding cells. Especially, three dimensional (3D) microfluidic cell culture system enables us to realize physiologically relevant cell culture model which is useful for understanding of structure-function relations in 3D cellular construct. In spite of these advantages, it has yet to be broadly used due to the technical difficulties in fabricating and operating it. The main purpose of my thesis is to develop 3D microfluidic cell culture systems which can be easily fabricated and operated by biologists and apply the systems for stem cell research. To accomplish this purpose, I first developed a simple gel-free 3D microfluidic perfusion cell culture system for culturing animal cells. For easy operation, I later simplified microfabrication and operation steps by modifying the structures of the 3D cell culture system. The feasibility of the simplified 3D cell culture system for culturing animal cells were demonstrated by transdifferentiating adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) into neurons under hypoxic condition at high cell density in the system. Finally, I developed a simple fabricating method of nanofluidic channels using UV-curable polymers. Based on the nanofabricating technique, I developed several nanopatterning methods and constructed the microfluidic system with integrated nanotopography to engineer stem cell niche where nanotopography plays important roles in differentiating stem cells into certain lineages. Chapter I offers a general overview about the microfluidic cell culture system and its applications. Chapter II describes a gel-free method for seeding and culturing mammalian cells three-dimensionally in microfluidic systems. To culture cells in a 3D shape in microfluidic cell culture system, various types of hydrogels made of natural and synthetic extracellular matrices (ECM) were previously incorporated into microfluidic cell culture systems. However, these hydrogels have several drawbacks in culturing animal cells because their polymerization process requires harmful ultraviolet (UV) exposure, the polymerized hydrogels lack of mass transfer and incorporation of hydrogels into the microchannel introduce operational. To avoid the use of hydrogel in my study, a transient inter-cellular polymeric linker and micro-fabricated pillar array were newly devised for the in situ formation and immobilization of 3D multi-cellular aggregates in a microfluidic channel, respectively. Compared with the hydrogel-based microfluidic cell culture system, this gel-free 3D microfluidic cell culture system (3D-μFCCS) requires simplified operation steps because the cellular construct formed in 3D-μFCCS would neither need animal-derived ECM components nor hydrogel embedment for cellular support. The feasibility of the gel-free 3D-μFCCS was demonstrated by perfusion culture of human liver cell line (C3A/HepG2) and primary rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) using the system. The cells displayed 3D cellular morphology while enhancing their cellular functions as well as differentiation capabilities. These results demonstrated the robustness of the system as a 3D cell culture platform for anchorage-dependent mammalian cells. Chapter III presents a simple microfluidic cell culture chip modified from the gel-free 3D-μFCCS. The chip was designed for static cell culture to effectively mimic hypoxic condition of stem cell niche. Human ADSCs have great potentials in regenerative medicines due to its active growth and differentiation potency. They can be differentiated into multiple mesodermal lineage cells through normal differentiation process, while they can be transdifferentiated into some ectodermal lineage cells through de-differentiation process. In this study, slurry of spheres derived from hADSCs was withdrawn into the microfluidic chip and trapped by a micropillar array in the middle of the microchannel and cultured in neural induction medium. Then, neurobasal medium supplemented with 20 ng/ml bFGF, 5 ng/ml BDNF and 2% FBS was added into the microchannel for neural induction of ADSCs. After 3 day of hADSCs chip culture, HIF1α expression was significantly increased. Along with this, Oct4 and Nanog expressions prominently increased in chip cultured cells, while conventional dish culture low expressions of Oct4 and Nanog respectively. After 7 days in on-chip culture, neurospheres were spread out and actively migrated from center of microfluidic channel layer into outside of microfluidic channel layer. Then, they started neural differentiation and express early neuronal marker TuJ-1and about 60% cells in total cell population differentiated GABA+ neurons after 14 days of the chip culture. These results suggest that high cell density in the microchannel induced hypoxic condition where HIF 1α and Oct4 were upregulated and directed the self-renewal and neurogenesis of hADSCs. In accordance of simplicity in microfabrication and cell culturing processes, these results demonstrated that the microfluidic cell culture chip is highly useful for engineering stem cell niches for differentiation of stem cells. Chapter IV describes a simple and low cost method for fabricating enclosed transparent hydrophilic nanochannels by coating low-viscosity PDMS (monoglycidyl ether-terminated polydimethylsiloxane) as an adhesion layer onto the surface of the nanotrenches that are molded with a urethane-based UV-curable polymer, Norland Optical Adhesive (NOA 63). In detail, the nanotrenches made of NOA 63 were replicated from a Si master mold and coated with 6 nm thick layer of PDMS. These nanotrenches underwent an oxygen plasma treatment and finally were bound to a cover glass by chemical bonding between silanol and hydroxyl groups. Hydrophobic recovery that is observed in the bulk PDMS was not observed in the thin film of PDMS on the mold and the PDMS-coated nanochannel maintained its surface hydrophilicity for at least one month. The potentials of the nanochannels for bioapplications were demonstrated by stretching λ-DNA (48,502 bp) in the channels. Therefore, this fabrication approach provides a practical solution for a simple fabrication of nanochannels for bioapplications. In Chapter V, I propose future research plans for understanding the rigidity and topography sensing mechanisms of stem cells by introducing several novel devices fabricated by methods modified from the method described in chapter IV. In this novel fabricating method, UV-curable polymer was covered by the transparent replica mold and the mask was placed on the transparent replica mold and then exposed to UV. After the UV exposure, the mask and the mold were removed away and uncured polymer on unexposed region was washed out using ethanol. Using this method, nanopatterns were fabricated in restricted micro- and milli-meter scale area and the nanopatterns were successfully integrated to a microfluidic cell culture channel. In addition, based on this method, I could also fabricate an array of nanopillars made of two kinds of polymers with different rigidity. The feasibility of this patterning technique was demonstrated by hADSC culture on the microfluidic channels with integrated nanopatterns.;미세 유체 세포 배양 시스템은 세포를 둘러싸고 있는 화학, 물리학적 미세환경 요소들을 제어함으로써 세포의 생체 내 미세환경을 모사할 수 있으므로 세포 연구에 유용한 도구가 된다. 특별히, 삼차원 세포배양 미세유체 시스템은 생리학적으로 생체와 매우 유사한 세포배양 모델로서 삼차원 세포 구조에서 구조와 기능의 연광성을 이해하는데 유용하다. 이러한 장점에도 불구하고 이의 제작과 사용의 기술적인 어려움으로 인해 아직까지는 널리 사용되지 못하고 있다. 이 논문의 주요 목적은 생물학자들이 쉽게 제작, 사용할 수 있는 삼차원 세포 배양 시스템을 개발하고 이를 줄기 세포 연구에 응용하는 것이다. 이 목적을 달성하기 위해, 먼저 겔을 사용하지 않는 삼차원 미세유체 관류 세포배양 시스템을 개발하고 이를 기본으로 구동과정과 제작과정이 더 단순화된 새로운 시스템을 개발하였다. 개발된 시스템은 지방조직 유례 줄기세포를 고밀도, 저산소 조건에서 배양 함으로써 신경 분화를 촉진하는 데에 응용 하여 생물학적 응용 가능성을 보여주었다. 추가적으로, 자외선 경화성 고분자를 이용하여 나노 채널을 제작하는 간단한 방법을 개발하였고, 이 기술을 기반으로 다양한 나노 패터닝 방법을 개발하고 이를 이용하여 줄기세포 분화 연구를 위한 나노 지형 구조물이 포함된 미세유체 시스템도 개발하였다. 나노 지형물은 줄기세포를 특정 세포로 분화시키는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 이는 다양한 줄기세포 연구에 이용될 수 있을 것으로 여겨진다. 제 1장은 미세유체 세포 배양 시스템에 대한 개괄적인 정보와 그의 응용분야에 대해 설명한다. 제 2장은 미세유체 소자 내에 겔을 사용하지 않고 삼차원으로 세포를 배양하는 방법에 대해 소개한다. 미세유체 세포배양 시스템 내에 서 삼차원으로 세포를 배양하기 위해서 일반적으로 천연, 합성물을 비롯한 다양한 종류의 하이드로겔이 세포 외 기질로서 이용되어 왔다. 그러나 이러한 하이드로겔은 삼차원 세포배양에 있어 많은 단점을 가지고 있다. 미세유체소자 내에서 졸상태의 고분자를 젤화 시키는 과정을 복잡하거나 겔화 과정에 자외선이 이용되기도 하며 배양 시에는 겔 내의 세포에게 영양물질 전달이 원활하지 못한 점이 단점이 될 수 있다. 따라서 본 시스템에서는 겔 사용을 배제하기 위해 세포 사이를 일시적으로 결합시켜 줄 수 있는 고분자 연결체를 사용하였고 미세 기둥 구조물을 통해 세포 결합체가 미세채널 내부에 고정 될 수 있도록 설계되었다. 이는 기존의 겔 기반 미세유체 세포배양 시스템과 비교하여 삼차원 세포 배양 환경을 구축하는 과정이 간소화 된 과정이다. 본 시스템의 타당성은 세포주 C3A/HepG2 와 초대 세포인 골수 유래 중배엽성 줄기세포의 배양을 통해 증명하였다. 이들 세포들은 본 시스템 배양에서 모두 삼차원 구조를 나타내었으며 활발한 대사 기능과 분화능을 보여주어 본 시스템이 다양한 부착 포유 동물 세포 배양에 이용될 수 있음을 확인시켜 준다. 제 3장은 앞선 삼차원 관류 세포 배양 시스템을 더욱 간소하게 변형시킨 배양 칩을 설명한다. 본 칩은 체내 줄기세포 적소의 저산소 환경을 효과적으로 모사하고자 정치 배양이 가능하도록 설계되었다. 지방조직 유래 줄기 세포는 (hADSCs) 활발한 세포 성장과 분화 능으로 재활의약계에 널리 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 이들 세포는 일반적으로 다양한 중배엽성 세포로 분화될 수 있을 뿐 아리나 역분화 과정을 거쳐 교차분화를 통해 외배엽성 세포로도 분화가 가능하다. 이러한 hADSCs 유래 원시 신경구를 미세칩 내부 미세 기둥구조물 내에 포획 하고 신경분화배지를 공급하여 신경 세포로의 분화를 유도하였다. 3일 간의 칩 배양 결과 세포 내 HIF1α 발현이 극적으로 증가하였고 이와 더불어 Oct4 and Nanog의 발현 또한 칩 배양 세포에서 확연히 증가되는 것을 확인하였다. 칩 배양 7일 후, 신경구는 미세 기둥 내부에서 바깥쪽 채널로 활발히 뻗어 나가며 이동하며 신경세포로 분화 되기 시작하여 초기 신경 마커인 TuJ-1을 발현하는 것을 확인하였다. 칩 배양 14일 후에는 전체 세포 중 60%에 이르는 세포가 GABA 발현 신경 세포로 분화 되었다. 이들 결과는 미세채널 내부의 고밀도 신경 구들이 저산소 환경을 형성하여 HIF 1α 발현을 유도하고 이를 통해 Oct4 발현 증가를 유도하여 hADSCs의 자가 재생과 분화를 조절하는 하는 것을 보여 준다. 제 4장은 친수성 나노채널 제작을 위한 새로운 저가의 간단한 공정기술을 소개한다. 본 방법은 우레탄 계열의 자외선 경화성 고분자 NOA63으로 제작된 나노 트렌치 표면을 저점도의 PDMS로 (monoglycidyl ether-terminated polydimethylsiloxane) 코팅기술을 이용하여 나노채널을 제작하는 방법을 이용하고 있다. 자세한 방법은 다음과 같다. 실리콘 주형으로부터 복제된 NOA63 나노 트렌치를 6 nm 두께의 PDMS 층으로 코팅한다. 이를 커버 글래스와 함께 산소플라즈마 실라놀 그룹과 하이드록실 그룹간의 화학적 결합에 의해 두 표면을 접착시켜 나노 채널을 완성한다. 일반적으로 벌크 PDMS 표면에서는 소수성 회복 현상이 빠르게 나타나지만, 본 공정의 나노 채널 표면상에 코팅된 PDMS 층에서는 최소 한달 이상 친수성이 유지 된다. 본 나노채널의 생물학적 응용 가능성은 나노채널 내부에서 λ-DNA (48,502 bp)의 스트레칭 실험을 통해 확인하였다. 제 5장은 4장의 나노 패터닝 방법을 기반으로 개발한 자외선 경화성 고분자를 이용한 다양한 나노 패터닝 기법을 소개하고 이 패터닝 기법의 줄기 세포 연구에의 응용 가능성 및 미래 연구 방향에 대해 논의한다. 본 패터닝 기법은 투명한 복제 몰드를 자외선 경화성 고분자위에 덮은 후, 다시 그위에 패턴 마스크를 덮고 자외선을 조사하는 방법을 사용한다. 자외선 조사 후, 패턴 마스크와 몰드를 떼어내고 자외선이 조사되지 않은 지역의 경화되지 않은 고분자를 에탄올로 씻어낸다. 이는 나노 구조물을 마이크로 또는 밀리미터 영역안에만 제한적으로 형성시키는 간단한 방법을 제공한다. 본 논문 에서는 이 기법을 이용하여 바닥에 나노 패턴이 형성된 마이크로 채널을 제작하였고 hADSC의 신경 분화 실험을 통해 그 응용 가능성을 확인하였다. 더불어, 본 패터닝 방법을 이용하여 한 어레이 상에 강도가 다른 두 종류의 고분자 나노 필라를 제작하여 물리적 환경 요소가 줄기세포에 미치는 영향에 관한 연구에 이용될 수 있는 플랫폼을 개발하였다.