Phylogenetic Analysis and E1 Gene Expression of Rubella Viruses Isolated in Korea

Abstract

Rubella virus is the causative of a mild, self-limiting disease, but if it is acqired in the early of pregnancy, usually results in congenital rubella syndrome (CRS). Seven rubella viruses were isolated in Korea in 1995-1996, recent epidemic period (Anam95, Anam96-1~6). To analyzed phylogenetic relationship between 7 Anam strains and rubella virus strains from other countries, rubella virus El gene of Anam strains was obtained by RT-PCR and sequenced. Nucleotide sequence of E1 gene (nt1-1443) of Anam strains showed 91.5%-96.3% identity compared with nucleotide sequence of other strains. In a phylogenetic tree, 4 Anam strains 96-2,-3,-5,-6 were classified into a single group with all isolates of other countries in the 1960s and 3 Anam strains Anarn95, Anam96-1, Anam96-4 formed a distinct group. It indicates a. possibility that at least two genotypes of rubella viruses were cocirculated in Korea in 1995-1996. In addition, rubella virus partial E l gene was cloned into expreesion vector, pGEX-5X-3 and induced in bacterial system. Partial E1 protein of rubella virus was expressed as 53kDa of E1-GST fusion protein, and it was reactive with goat anti-rubella antiserum. ;풍진은 주로 소아에서 미열, 발진이 주증상이나 임신 초기에 감염되었을 시는 선천성 풍진 증후군 환아를 출산할 가능성이 크고, 그 증상은 정신박약과 청각장애, 백내장 및 심장이상 등 심각한 정신적, 신체적 합병증이 동반되는 치명적 결과가 수반될 수 있다. 국내에서는 1986년 이후 실시된 백신정책에도 불구하고 1995-1996년 풍진이 다양한 연령에서 유행하였으며, 이때 국내에서 7주의 풍진바이러스가 분리되었다. 분리된 국내 풍진바이러스의 계통분석을 위해서 Vero E6 세포에서 배양된 풍진바이러스를 배양상층액으로부터 RNA를 추출하여 풍진바이러스 E1 유전자 specific-primer로 역전사효소 중합반응을 실시하고, direct sequencing으로 염기서열을 결정하였다. 국내에서 분리된 풍진바이러스의 E1 gene부위의 염기서열을 분석한 결과 국내에서 사용하고 있는 풍진예방백신주인 RA27/3 과 비교시, 91.5%-96.6%의 동질성을 보였으며, 국내분리주 상호간에는 91.6%-100%의 동질성을 나타내었다. 결정된 염기서열변이 중 codon의 세 번째 위치의 변이가 주로 발생하였으며 deduced 아미노산서열에서는 변이를 보이지 않는 silent mutation이 대부분 이었다. 풍진바이러스의 E1유전자를 이용한 계통분석결과는 4주 (Anam96-2, Anam96-3, Anam96-5, Anam96-6)의 국내 풍진바이러스는 기존에 미국, 영국 등에서 분리되었던 풍진바이러스와 동일한 그룹을 형성하였고, 3주 (Anam95, Anam96-1, Anam96-4)는 기존에 알려진 풍진바이러스와 높은 변이양상(0.2%-9.7%)을 나타내어 기존것과 다른 새로운 genotype으로 중국주들과 동일 그룹을 형성하였다. 이와같은 특이한 그룹형성은 1995-1996년 국내에서는 최소한 두 가지 다른 genotype의 풍진바이러스가 서울인근지역에서 동시에 유행하였음을 나타낸다. 계통분석을 통해 새로운 그룹에 속하는 국내 풍진바이러스의 E1 유전자 일부를 PCR 법으로 만든 후, 단백질 발현 벡터 pGEX-5X-3에 cloning 하였고, 숙주인 대장균에서 fusion 단백질을 발현시켰다. 발현된 단백질은 Immune-blotting에서 anti-rubella 항체와 specific한 반응이 보여지므로 대장균내에서 발현된 풍진바이러스 E1 단백질임을 확인하였다.