Chitin 분해 세균의 분리 및 Chitinase의 특성

Abstract

바닷가의 모래에서 chitin을 분해할 수 있는 균주를 chitinase detection agar 배지를 이용하여 분리하여 형태적, 생리적 특성을 조사한 결과, Cytophaga sp.로 동정되어 Cytophaga sp. HJ로 명명하였다. Chitinase를 생성하는 배양환경은 초기 배지 pH를 7.0으로, 배양온도를 20℃로, 질소원으로 yeast extract와 peptone을 각각 0.5%씩 넣어 주었을 때 가장 이상적인 것으로 나타났으며, chitinase는 균의 성장과 extracellular protein의 분비량에 비례하여 생성이 증가하였다. 이 균주가 내는 chitinase는 기질인 chitin에 의해 유도되는 효소였으며 생성 후 균체 외로 완전히 분비되는 exochitinase였다. Cytophaga sp. HJ가 분비하는 chitinase를 분리하기 위하여 균주배양액으로부터 ammonium sulfate fractionation(30-80%)을 하여 얻은 조효소액으로 anion exchange를 이용한 DEAE-Bio gel A column chromatography와 hydrophobic interaction을 이용한 Octyl-Sepharose column chromatography를 실시하여 각기 다른 활성을 지닌 chitinase A, B를 얻었고, 분리된 효소의 정제 정도를 확인하고 분자량을 측정하기 위하여 10% SDS-PAGE analysis를 하였을 때 chitinase A 활성분획에서는 45KDa의 주 band를 확인할 수 있었고 chitinase B 활성분획에서는 분자량이 각각 74.9, 64.7KDa인 2개의 band를 확인하였다. Chitinase B 활성분획에서 보이는 2개의 단백질이 dimer 형태로 chitinase 활성을 보이는지 알아보기 위하여 10% Native-PAGE analysis를 하였고 그 결과, 2개의 band가 별개의 단백질임을 확인하였다. Chitinase A, B는 각각 효소 1㎎이 1분간 N-acetyl-D-glucosamine 2.8, 5.2μmol을 유리시킬 수 있었으며 이는 Streptomyces griseus가 생성하는 chitinase의 활성보다 각각 3.8, 7배 가량 높은 활성이었다. Chitinase A는 pH 4.0에서 가장 활성이 좋으나 chitinase B는 중성에서 높은 활성을 보였고, chitinase A, B 모두 pH가 낮아짐에 따라 효소의 안정성이 떨어지는 것으로 나타났다. 온도에 의한 영향은 chitinase A, B가 비슷한 양상을 보였는데 40℃에서 가장 활성이 우수하고 50℃를 넘으면서 급격히 안정성이 떨어졌다. Metal agent에 의한 효소의 활성은 chitinase A가 chitinase B에 비해 활성변화의 폭이 컸으며 CaCl_(2), SbCl_(3)에 의해 chitinase A의 활성이 각각 248, 300%로 크게 증가되었고 Pb(NO_(3))_(2)에 의해서는 chitinase A, B의 활성이 100% 억제되었다. Colloidal chitin을 기질로 하여 기질의 농도 변화에 따른 효소의 활성을 측정한 결과, chitinase B의 K_(m)값은 0.065%로 chitinase A의 0.101%보다 작았고 반면, V_(max)값은 chitinase A와 B 각각 0.323unit/㎖, 0.508unit/㎖이었다.;A bacterial strain producing chitinase was isolated from sea sand through enrichment culture in colloidal chitin media. The isolate was identified as Cytophaga sp., based on its morphological and physiological characteristics. The chitinase was extracellular enzyme and inducible by chitin. The optimal culture condition for chitinase production was pH 7 and 20℃. The enzyme protein was purified by using ammonium sulfate fractionation(30-80%), DEAE-Bio gel A and Octyl-Sepharose CL-4B column chromatography. Two major chitinases A and B were detected during the purification steps. The chitinase A showed 45KDa single band on 10% SDS-PAGE, but chitinase B contained 74.9 and 64.7 KDa bands which appeared as two separate bands even in native gel. The specific activities of chitinase A and B were 2.8 and 5.2 μmol/mg protein/min, respectively. The optimal condition for chitinase A reaction was pH 5 and 40℃ and cntinase B showed its best activity at pH 7 and 40℃. CaCl_(2) and SbCl_(3) enhanced chitinase activity significantly. K_(m) value were 0.101% colloidal chitin for chitinase A and 0.065% for chitinase B. V_(max) were 0.323 U/ml for chitinase A and 0.508 U/ml for chitinase B.