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dc.description.abstractNucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding nucleoside diphosphate (NDP) as following: N_(1)TP + E ↔ N_1DP + E-P N_(2)DP + E~P ↔ N_2TP + E The reaction has ping-pong kinetics and involves a phosphohistidine intermediate of the enzyme. The primary role of NDP kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphates, such as UTP and CTP, required for the nucleic acid biosynthesis. Recently, the interest of NDP kinase increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. NDP kinases are highly conserved set of sequences throughout evolution from bacteria to human. Human NDP kinase is composed of two subunits of 17 kDa polypeptide chains (A and B) which are the products of nm23-Hl and H2 gene. Nm23-Hl was thought as a suppressor of metastasis for some tumour types. Nm23-H2 was shown to be identical to PuF, a protein that binds to a nuclease-sensitive element on the Promoter of c-myc oncogene, and activates transcription of the c-myc oncogene in vitro. However, the biological function of NDP kinase in tumor metastasis and in cell differentiation is not illustrated. We have tried to examine the different cellular functions of NDP kinase isoforms. We purified three types of NDP kinases by ATP-agarose affinity column chromatography; native forms in human erythrocyte, recombinant Nm23-Hl and Nm23-H2. Because of dual functions of NDP kinase, enzyme activity and DNA binding properties, we investigated both characteristics of NDP Kinase isoforms. Enzyme stabilities were tested by various denaturants including heating, urea or DEPC treatment. The autophosphorylation patterns were compared with each other by various treatment. The DNA binding Properties of each NDP kinases were investigated with electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using c-myc, nm23-H2 and Timp-l(tissue inhibitor of metalloproteases-1) promoter as specific DNA probes. These results indicated that biological functions of each NDP kinase isoforms are different. We will further investigate the structure and in vivo biological functions.;Nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase)는 nucleoside triphosphate (NTP)의 γ-phosphate를 nucleoside diphosphate (NDP)에 이동시키는 효소로 그 반응은 다음과 같다. N_(1)TP + E ↔ N_(1)DP + E-P N_(2)DP + E∼P ↔ N_(2)TP + E 이 반응은 ping-pong mechanism이며, 반응 중간체로 phosphohistidine을 포함한다. 세포 내에서 NDP kinase의 주된 역할은 생합성에 필요한 CTP와 UDP와 같은 nucleoside triphosphate (NTP) pool의 유지로 생각된다. 최근 NDP kinase는 암전이 억제 유전자인 ㎚23의 gene product와 동일하다는 것이 밝혀짐에 따라 그 관심이 고조되고 있다. NDP kinase는 bacteria에서 사람에 이르기까지 다양하게 분포하며, highly conserved sequence를 가진다. Human NDP kinase는 17 kDa의 polypeptide chain A, B로 이루어져 있으며 각각 ㎚23-H1, ㎚23-H2 gene product와 동일하다. Nm23-H1은 일부 tumor type에서 암전이 억제 인자로 작용하며, Nm23-H2는 c-myc oncogene promoter의 nuclease-sensitive element에 binding하며 in vitro에서 transcription을 활성화시키는 단백질인 PuF와 동일하다는 것이 알려졌다. 그 역할에 있어 암전이와 세포 분화에 관계가 있으리라고 생각되나 NDP kinase의 생체 내 기능이 정확히 무엇인지는 전혀 밝혀져 있지 않다. 본 실험에서는 NDP kinase와 그 isoform들의 세포내 기능적 차이에 대하여 연구하였다. ATP-agarose affinity column chromatography를 이용하여, native form의 NDP kinase와 두 isoform들을 각각 인간의 적혈구와 recombinant ㎚23-H1과 ㎚23-H2로부터 순수 분리하였다. NDP kinase는 효소 활성과 DNA에 binding하는 서로 다른 두 가지 기능을 가진 단백질이므로 각각의 isoform에 대하여 이 기능을 비교 연구 하였다. 각각의 효소에 대한 특성을 알아보기 위하여 heat, urea, DEPC가 효소 활성에 미치는 영향을 관찰하였고, native NDP kinase와 Nm23-H1, Nm23-H2의 자가인산화의 유형을 비교하였다. 또한 DNA에 binding하는 성질을 c-myc, ㎚23-H2, Timp-1 (tissue inhibitor of metalloproteases-1)의 promoter 부위를 probe으로 사용하여 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 실시하여 비교하였다. 본 연구 결과에 의하면 native NDP kinase, recombinant Nm23-H1, Nm23-H2의 생화학적 기능이 다른 것으로 나타났다. NDP kinase의 구조와 세포 내에서의 가능에 대한 연구는 앞으로 이루어져야 할 과제이다.-
dc.description.tableofcontents목차 = ⅲ 논문개요 = ⅹ Ⅰ. 서론 = 1 Ⅱ. 실험 = 10 1. 시약 및 기기 = 10 1.1 재료 및 시약 = 10 1.2 기기 및 장치 = 12 2. 인간 NDP kinase와 그 recombinant isoform의 순수 분리 = 14 2.1 인간 적혈구로부터 native NDP kinase의 순수 분리 = 15 2.2 Recombinant Nm23-H1과 Nm23-H2의 순수 분리 = 16 3. SDS-PAGE = 17 4. Western analysis = 19 5. 단백질 농도 결정 = 20 6. Native 상태에서 단백질의 구조 결정 = 20 6.1 Non-denaturing PAGE = 20 6.2 Capillary electrophoresis = 22 7. NDP kinase의 활성도 측정 = 22 7.1 NDP kinase assay = 22 7.2 NDP kinase의 기질에 대한 특이성 = 23 7.3 효소 활성의 안정성 : 온도 변화와 urea에 의한 효과 = 23 7.4 효소 활성의 억제 : Diethyl pyrocarbonate (DEPC)에 의한 효과 = 24 8. 단백질 인산화 = 24 8.1 자가인산화 = 24 8.2 단백질 인산화 = 25 9. 단백질의 DNA binding 성질 확인을 위한 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) = 25 9.1 DNA probe의 제조 = 25 9.2 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) = 33 9.3 Binding buffer 효과 = 34 9.4 Competition assay = 35 Ⅲ. 결과 및 고찰 = 36 1. 인간의 적혈구에 존재하는 native form의 nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase)의 순수 분리 = 36 2. NDP kinase의 cell line에 따른 분포 및 cell 내의 존재 부위 확인 = 38 2.1 Cell line에 따른 NDP kinase의 분포 = 38 2.2 Cell 내에서의 NDP kinase의 존재 부위 확인 = 38 2.3 Colorectal cancer tissue에서의 Nm23 단백질의 발현 = 40 3. Recombinant human Nm23-H1과 Nm23-H2의 순수 분리 = 42 3.1 Recombinant Nm23-H1과 Nm23-H2 단백질의 발현 확인 = 42 3.2 Recombinant human Nm23-H1과 Nm23-H2의 순수 분리 = 42 4. Native 상태에서 단백질의 구조 결정 = 45 4.1 Non-denaturing PAGE = 47 4.2 Non-reducing PAGE = 47 4.3 Capillary electrophoresis를 이용한 구조 분석 = 49 5. NDP kinase의 활성도 측정 = 52 5.1 Enzyme kinetics = 52 5.2 NDP kinase의 기질에 대한 특이성 = 54 5.3 효소 활성의 안정성 : 온도 변화와 urea에 의한 효과 = 58 5.4 효소 활성의 억제 : DEPC에 의한 효과 = 58 6. 단백질의 인산화 = 61 6.1 자가인산화 = 61 6.2 단백질 인산화 = 67 7. Native NDP kinase, recombinant Nm23-H1과 Nm23-H2의 DNA에 binding 하는 성질 = 67 7.1 Nm23-H2 promoter region에 대한 native NDP kinase와 recombinant isoform의 DNA에 binding 하는 성질 = 69 7.2 Timp-1 promoter region에 대한 native NDP kinase와 recombinant isoform의 DNA에 binding 하는 성질 = 76 Ⅳ. 결론 = 86 참고문헌 = 89 Abstract = 102-
dc.format.extent6254669 bytes-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.subjectNDP kinase-
dc.subject효소 활성-
dc.subject효소 기능-
dc.title인간 NDP kinase (NM23)의 효소 활성 및 기능에 관한 연구-
dc.typeMaster's Thesis-
dc.title.translatedFunctional and structural studies of human NDP kinase (Nm23)-
dc.format.pagexi, 103p.-
dc.identifier.major대학원 약학과- 2-
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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