국내에서 분리된 반코마이신 내성 장구균의 항생제감수성과 유전자형의 양상 및 위험인자에 대한 연구

Abstract

VRE는 그람양성 구균으로 최근 vancomycin에 대한 내성이 보고되어 그 관리의 중요성이 시급한 문제로 제기되고 있다. 본 연구는 국내 00병원에서 혈액종양 내과와 소화기 내과에 입원한 환자 62명중에서 검출된 위장관 집락을 형성한 enterococci 중 vancomycin 내성 장구균(vancomycin resistant enterococci, VRE)으로 판단되는 7균주와 환자의 임상검체에서 발견되어 VRE 추정되는 3균주에 대해 동정에 이어 한천희석법에 의해 phenotype(Van A, B, & C)을 결정하고 중합효소 연패반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 genotype(vanA, B, & C)을 확인하였으며 VRE 발생위험인자에 대해 조사하여 비교하였다. 본 연구 대상으로 한 10균주는 모두 그람염색과 6.5% 식염배지에서의 성장 등으로 enterococci임이 확인되었고 Vitek system으로 항생제 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정시 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)기준에 따른 감수성 기준치(MIC≤4㎍mL^(-1))를 초과하여 vancomycin에 내성 균주로 판단되었다. 균주의 동정 및 Vitek system과 한천희석법에 의한 신빙성 있는 항생제 감수성 검사를 실시하여 VRE의 표현형(phenotype)을 결정하였고 PCR을 통해 유전자형(genotype)을 확인하였으며 의무기록지를 검토를 통해 VRE 발생위험인자에 대해 연구하였다. VRE가 추정되는 10균주 중 2균주는 Enterococcus faecalis, 2균주는 E. faecalis였고 6균주는 E. casseliflavus였다. 그 중 임상검체에서 나온 3균주는 모두 E. casseliflavus였다. E. faecalis 2균주와 E. faecium 2균주 등 총 4균주는 vancomycin(MIC>256㎍·mL^(-1))과 teicoplanin(MIC>32㎍·mL^(-1))에 고도내성을 나타내 VRE 표현형 VanA로 판정하였다. E. casseliflavus 6균주는 vancomycin에 낮은 내성(4㎍·mL^(-1)<MIC<32㎍·mL^(-1))을 나타내고 teicoplanin에 감수성(MIC≤4ug·mL^(-1))을 나타내는 VRE 표현형 VanC였다. 임상검체 10균주 중 E. faecium 1균주와 E. faecalis 1균주만 ampicillin(≥16㎍·mL^(-1)), ciprofloxacin(≥16㎍·mL^(-1))과 penicillin(≥4㎍·mL^(-1))에 내성을 나타냈고 8균주는 모두 감수성을 보였다. Penicillin이나 glycopeptide에 aminoglycoside 약물을 병용투여시 상승작용을 나타내는지를 확인하기 위한 고농도 aminoglycoside에 대한 항생제 감수성 결과 gentamicin(50㎍·mL^(-1))에는 E. faecalis 1균주만 내성을 보여 90%의 균주에서 상승작용이 나타날 수 있음을 보였고 고농도 streptomycin(2,000㎍·mL^(-1))에는 E. faecium 1균주, E. faecalis 1균주와 E. casseliflavus 3균주에서 내성을 보여 50%정도에서만 병용투여시 상승작용이 기대되었다. 1993년 Clark 등이 사용한 vanA, vanB와 vanC에 특이하게 합성된 DNA primer sets를 사용하여 PCR 생성물을 전기영동하여 그 밴드를 확인함으로써 VRE 유전자형을 확인한 결과 표현형과 동일하게 E. faecalis와 E. faecium은 모두 vanA이었고 E. casseliflavus 6균주는 vanC였다. VRE 발생에 영향을 미치는 위험인자를 파악하기 위하여 VRE 집락이 발견된 환자(n=7)와 동일한 조건에서 enterococci 집락형성이 관찰된 환자 중 vancomycin에 감수성을 보이는 enterococci(vancomycin susceptible enterococci, VSE)의 집락이 발견된 환자(n=55)와 평균 나이, 항생제 사용 및 카테터 사용경험 등을 비교하여 분석하였다. VRE군의 평균 나이는 60.0±8.3세로 VSE군의 48.7±15.5세에 비해 11,3세 높았고 vancomycin과 3세대cephalosporin을 포함한 항생제 사용경험과 카테터 설치 비율이 높았으며 사용한 항생제 종류도 약 1종 많았다. VRE가 임상검체에서 발견된 환자(n=3)에서 VRE 집락을 형성한 환자(n=7)와 비해 vancomycin과 3세대 cephalosporin을 포함한 항생제 사용 경험비율, 사용한 항생제 종류, 카테터 사용비율 등이 높아 일반적으로 보고되는 VRE 발생 위험인자와 유사했다. 이와 같은 VRE 존재로 이들 균주에 의한 감염시 효과적인 항생제가 개발되어 있지 않고 그 내성이 빠르게 확산되므로 치료에 심각한 문제가 예상된다. 따라서 이들 균주의 발생 및 감염 확대를 예방하는 노력과 함께 VRE의 특성과 치료에 대한 지속적인 기초 및 임상적 연구가 요구된다.;This study was carried to test antibiotic susceptiblility, genotype and analysis risk factor of 7 suspected vancomycin resistant enterococci(VRE) which were suspected VRE (minimum inhibitory concentration for vancomycin >4㎍·mL^(-1)) in stool and 3 suspected VRE in clinical specimens collected from ○○hospital. 10 VRE were identified and determined the phenotype on the basis of the level of resistance to vancomycin and teicoplanin using Vitek system and agar dilution method. And these were confirmed by polymerase chain reaction(PCR) with primer sets specific for the vanA, vanB and vanC. PCR products were separated on 1.8% agarose gels and compared with the expected sizes for each geotype. Isolate were as identified as 2 E. faecium, 2 E. faecalis, and 6 E. casseliflavus. Of the 10 VREs, 2 E. faecium and 2 E. faecalis were all high level resistant to vancomycin(minimum inhibitory concentration, MIC>256㎍·mL^(-1)) and teicoplanin (MIC>32㎍·mL^(-1)), thus all were identified as phenotype VanA. 6 E. casseliflavavus were all low level resistant to vancomycin(4㎍·mL^(-1)<MIC<32㎍·mL^(-1)), and susceptible to teicoplanin(MIC<4㎍·mL^(-1)) , thus all were identified as phenotype VanC. 10 VREs were analyzed by PCR by using primer sets specific for the vanA, vanB, and vanC genes. 4 of 10 isolates with the VanA phenotype produced the expected 1007bp product with the vanA primer sets. 6 of 10 isolates with the VanC phenotype produced the expected 796bp product with the vanC primer sets. Patients with VRE colonized were older(60.0±8.3) and treated more frequently with vancomycin and third generation cephalosporins and the number of antibiotics used were greater than those who had VSEs. Futhermore, catether was used more frequently on VRE patients. Patients with VRE in clinical specimen were treated more frequently with vancomycin and third generation cephalosporins and the number of antibiotics used were greater than patients with VRE colonized Futhermore, catether was used more frequently on VRE patients in clinical specimen. The risk factors identified in this study is consistent with the previous reports. It is suggest that further study is needed to define risk factors f a r WE developement in Korea.