사람 유방암 MCF-7세포에서의 CYP1A1유전자 발현조절에 관한 연구

Abstract

Cytochrome P450 enzymes have been intensively investigated in hepatic tissues and several mammalian cell lines. Compared to most studies about cytochrome isozymes in liver in vivo and hepatic cell lines in vitro, the study of cytochrome P4501A1 in human breast cancer cells could be important to understand the mechanism of the regulation of CYP1A1 gene expression. MCF-7 human breast cancer cells are well characterized to study estrogen and antiestrogen action due to the fact that they contain high level of estrogen receptor and have biological markers characterized. And also MCF-7 cells expressed high level of arylhydrocarbon hydroxylase activity and human cytochrome P4501A1 cDNA was cloned from MCF-7 cells. Ah receptor was characterized in many breast cancer cell lines and polycyclic aromatic hydrocarbon such as 3-MC induced the expression of CYP1A1 gene and cytochrome P450-dependent monooxygenase activity. We undertook a study to examine the effect of estrogen and other chemicals such as flavonoids, retinoids, glucocorticoids on the regulation of human CYP1A1 gene expression in MCF-7 cells via RTPCR and EROD activity assay, that might help us to understand the mechanism of the regulation of CYPlAl gene expression. Expression vector containing the functional 5'-flanking region of human CYP1A1 gene fused to the CAT reporter gene was transfected into estrogen receptor positive MCF-7 cells or estrogen receptor negative MDA-MB 231 cells. After these cells were treated with various chemicals, RTPCR was carried out to measure both CYP1A1 mRNA and CAT mRNA levels. 1 nM 3-MC increased in both CYP1A1 mRNA and CAT mRNA levels over those of control by two folds in MCF-7 cells but dose not in MDA-MB 231 cells. Chemicals such as estradiol, tamoxifen, chrysin decreased in both CYP1A1 mRNA and CAT mRNA levels that were induced by 3-MC in MCF-7 when each chemicals was pretreated. Retinoic acid and dexamethasone increased both CYP1A1 mRNA and CAT mRNA levels like 3-MC when they were given to cells alone. Retinoic acid has inhibitory effect but dexamethasone does not have inhibitory effect on the 3-MC induced expression of CYPIAI gene. The EROD activities showed good correlation with results of CYP1A1 mRNA induction. Our data suggested that these effects of chemicals on the regulation of CYP1A1 gene expression were mediated through the mechanism distinct from the binding to estrogen receptor. Therefore we might conclude that the expression of CYPlAI gene was modulated via ER system in MCF-7 cells and other steroids, flavonoids, retinoic acids seemed to enfluence on the estrogen receptor action on the expression of CYP1A1 in MCF-7 cells.;사람 유방암 세포에서의 cytochrome P4501Al의 유전자 조절 메커니즘을 연구하기 위하여 사람의 CYP1A1 유전자의 5'-flanking 부위를 CAT reporter gene을 포함하는 vector의 promoter 앞에 연결한 P4501Al-CAT을 MCF-7세포와 MDA-MB 231 세포에 transfection하고 여러 화학 물질을 처치하여 발현되는 CAT mRNA와 CYP1A1 mRNA를 RTPCR의 방법으로 정량했다. 또 CYP1A1 유전자의 생리 활성 지표인 EROD 활성 측정도 수행하였다. 에스트로겐 수용체가 발현되는 MCF-7 세포에 3-MC를 처치했을 때, CAT mRNA와 CYP1A1 mRNA 발현이 증가되었으며 EROD 활성도 증가되었다. 그러나 에스트로젠 수용체가 없는 MDA-MB 231세포에서는 3-MC 처치에 의해 CAT mRNA 및 CYP1A1 mRNA 발현 뿐 아니라 EROD 활성도 증가되지 않았다. 에스트로젠 의존성 세포 증식을 나타내는 MCF-7 세포에서 estrogen과 antiestrogen이 3-MC에 의해 증가된 CAT mRNA 및 CYP1A1 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 17β긴-estradiol 및 tamoxifen을 각각 3-MC와 병용 투여했을 때, 발현되는 CAT mRNA와 CYP1A1 mRNA는 3-MC 단독 투여시보다 감소됨을 볼 수 있었다. Flavonoid가 3-MC에 의해 증가된 CAT mRNA 및 CYP1A1 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 chrysin을 3-MC와 병용 투여했을 때, 3-MC 단독 투여시보다 발현되는 CAT mRNA와 CYP1A1 mRNA가 감소되었다. 세포분화촉진제로 알려진 retinoic acid가 3-MC에 의해 증가된 CAT mRNA 및 CYP1A1 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 all trans-retinoic acid를 3-MC와 병용 투여한 경우, 3-MC 단독 투여시보다 발현되는 CAT rnRNA와 CYP1A1 mRNA가 감소되었다. 약물대사효소의 활성 변동은 이상의 mRNA 변동과 일치하는 경향을 나타내어 estrogen, tamoxifen, chrysin, retinoic acid가 MCF-7 세포에서는 3-MC에 의해 증가된 EROD 활성을 저하시켰다. 부신피질호르몬이 3-MC에 의해 증가된 CAT mRNA 및 CYP1A1 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 dexamethasone을 3-MC와 병용 투여하고 3-MC 단독 투여시와 비교하면, CAT mRNA와 CYP1A1 mRNA 발현은 증가되고 EROD 활성은 감소 하는 경향을 볼 수 있었다. 위와 같은 CAT mRNA, CYP1A1 mRNA 발현 및 EROD 활성 변동이 에스트로젠 수용체를 매개하여 발생하는 현상인지를 조사하기 위하여 에스트로젠 수용체에 대한 경쟁 결합 실험 (competitive binding assay)를 행한 결과, cytochrome P4501A1 유전자 발현에 영향을 미치는 3-MC, retinoic acid, dexamethsone 등은 에스트로젠 수용체에 대한 유의적인 친화력이 관찰되지 않았으며, 이로부터 이들 화학 물질이 에스트로젠 수용체에 직접 결합하는 것과는 다른 작용을 통해 효과를 나타내는 것으로 사료된다.