Baculovirus 곤충세포 발현체계를 이용한 사람의 무스카린성 아세틸콜린 수용체 subtype Hm1과 Hm2의 발현

Abstract

무스카린성 아세틸콜린 수용체 (muscarinic acetylcholine receptor; mAChR)는 GTP-결합 조절 단백질과 밀접하게 관련된 수용체로서 말초 및 중추신경계에서 다양한 신경 생리학적 질병에 관여하는 것이 밝혀지면서 그 중요성에 대한 인식이 점차 증가되고 있다. 이러한 mAChR 는 생채 내에서 그 발현도가 낮고 동일 조직 내에 여러 subtype들이 동시에 발현되며 한 subtype에서만 높은 선택성을 보이는 약물은 없기 때문에 각 subtype별로 그 기능적 특성을 연구하기 어렵다. 그러나 각 subtype의 cDNA를 이용하여 mAChR가 존재하지 않는 heterologous한 세포에서 발현시킬 경우 특정 subtype에 대해서만 정확한 구조와 기능 규명에 관한 연구를 할 수 있다. 본 논문에서는 포유동물의 환경과 상당히 유사하면서도 다량의 단백질을 발현시킬 수 있는 baculovirus/곤충세포 발현 체계를 이용하여 사람의 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (Human mAChR) subtype Hml과 Hm2를 발현시켰다. 먼저 Hml과 Hm2의 cDNA를 baculovirus transfer vector (pBlueBac4)에 subcloning시키고, 재조합 효율 (recombination efficiency)를 증가시키기 위해 linearize시킨 parental viral genomic DNA와 함께 liposome을 이용하여 곤충세포 (Sf9 cell)에 co-transfection시켜 homologous recombination에 의해 재조합 virus의 생성을 유도하였다. Co-transfection된 세포 배양액의 상징액 (viral soup)을 단계적으로 희석하여 Plaque assay를 통해 재조합 virus일 경우에만 발현되는 Lac-Z gene을 indicator로 사용하여 blue plaque을 확인함으로서 가능성 있는 Hml 또는 Hm2 recombinant baculovirus를 선별했다. Blue plaque들을 곤충세포 배양 배지에 다시 현탁 시킨 다음 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 통해 DNA단계에서 재조합 바이러스의 여부를 확인했으며 northern blot anaysis를 통해 재조합 바이러스에 의해 감염된 곤충세포에서 1.5 kb에 해당하는 Hml 또는 Hm2 mRNA가 전사(transcrption) 되었음을 확인하였다. 또한 발현된 수용체가 활성이 있는 기능성 단백질 인지의 여부를 확인하기 위해 비선택성 길항제인 [^(3)H]-QNB (Quinucli-dyl[phenyl 4-^(3)H] benzilate)를 이용한 radioligand-binding assay를 실시하여 결합 친화력 (Kd)과 수용체의 수 (Bmax)를 측정하였다.;Human Muscarinic Acetylcholine receptor (Human mAChR) subtypes m1 and m2 were expressed using baculovirus/insect cell expression system. Suncloned expression vectors of Hm1 and Hm2 were co-transfected with Bac-N-Blue parental DNA in Sf9 cell and the viral supernatant was collected after 3 and 6 days of co-transfection. To select the recombinant virus whose genome incorporated the cDNA of Hm1 or Hm2, plaque assay was done with serial dilution of viral supernatant, and the separated blue plaques were collected and resuspended in complete TNM-FH. PCR data showed that 7 plaques which were selected were all recombinant, and the identified plaques were amplified in insect cell monolayer and the titer was tested by way of plaque assay. Northern blot analysis showed the proper size of band corresponding Hm1 and Hm2, which showed that the incorporated foreign cDNA was transcripted in baculovirus/insect cell expression system, and relatively high density of band strongly suggest the overexpressin of foreign gene. [^(3)H]QNB-labled binding assay was done in the presence of atropine, which showed non-specific binding, and in the absence of atropine, which showed total binding.오후 4:10 04-03-29 The results showed that the expressed mAChR using baculovirus/ Sf9 cell retained its binding activity, that is, it retained biological activity.