HNFs에 의한 Cyp1a1 유전자 발현 조절 및 Ames test를 이용한 유전독성 평가법

Abstract

Hepatocyte nuclear factor (HNF)는 간에서의 cytochrome P450의 발현에 중요한 transcription factor이다. 간 특이적 P450 발현 분자 메커니즘은 간의 P450 발현이 transcriptional level에 의해 우선적으로 결정되고 C/EBP, HNF1α, HNF3γ, HNF4α 같은 간에 풍부한 transcription factor의 복합적 작용에 의지한다는 것을 보여준다. HNF4α는 간에서 선택적으로 발현되는 nuclear receptor super family 중의 하나로 간에 풍부한 여러 transcription factor 중 간 특이적 유전자 발현에 가장 중요하다. HNF4α 이종 중합체는 특이한 DNA sequence element (DR1)과 결합하고 외인적으로 삽입된 ligand 없이 전사를 촉진시킨다. HNF4α는 간에서의 P450 발현에 중요한 인자라는 것이 알려져 있다. Cyp1a1 유전자 조절 기전의 이해를 돕기 위하여 이러한 HNFs 등의 핵 내 수용체와 Cyp1a1 유전자 발현 사이의 상관성을 알아보고자 mouse의 Cyp1a1 5'-flanking DNA를 luciferase reporter 유전자를 포함한 vector에 clone하여 Hepa-I 세포에 pHNFs와 co-transfection 한 뒤, 여러 가지 화합물을 처리하여 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. Hepa-I 세포에 pmCyp1a1-Luc과 HNFs를 농도별로 co-transfection 한 후, 0.1 % DMSO 또는 0.1 nM TCDD를 처치하였을 때, HNFs subtype 별로 그 활성의 정도는 다르지만 basal level에서의 변화를 보면 HNFs 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 경향을 보인다. HNF1α과 HNF4α는 80 ng 에서, HNF1β는 100 ng 에서 그 활성이 가장 높아지고 그 이후의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 보인다. TCDD를 처치한 경우 basal level에 비해 아주 높은 활성을 나타내며 그 변화 양상은 basal level에서의 경향과 비슷하다. 17β-Estradiol을 TCDD와 병용 처치한 경우, TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 그리고 pHNFs를 co-transfection 한 경우 17β-estradiol은 HNF1α에서는 농도의존성은 보이지 않았으나 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 감소시켰다. HNF4α에서는 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 감소시키지 못했으나, 17β-estradiol의 농도가 증가함에 따라서 luciferase 활성이 감소되었다. 합성 여성호르몬의 일종인 diethyl stilbestrol(DES)은 TCDD에 의해 유도된 luciferase 활성이 대조군에 비해 유의적인 변화를 나타내지 않았다. pHNFs를 cotransfection한 경우에도 DES는 TCDD에 의해 유도된 luciferase 활성이 대조군에 비해 유의적인 변화를 나타내지 않았다. 저산소 상태 유도 물질인 cobalt chloride는 NHF4α를 도입하지 않았을 때와 NHF4α를 도입하였을 때 모두에서 TCDD에 의한 luciferase 활성증가를 농도 의존적으로 억제하였다. 하지만 luciferase 활성이 감소되는 폭은 NHF4α를 도입하였을 때가 HNF4α를 도입하지 않았을 때보다 줄어들었다. Chrysin, daidzein, genistein, morin, naringenin 같은 flavonoid에 대해서도 실험한 결과 이러한 flavonoid는 대조군에 비해 유의적인 변화를 나타내지 않았다. 복귀돌연변이시험(Ames test, Reverse mutation test)은 전세계에서 발암물질을 검색하고자 할 때 가장 먼저 수행되어지는 가장 기본적인 시험법으로서, salmonella typhimurium 유래의 히스티딘 영양 요구성 변이주(histidine auxotroph)를 이용하여 시험물질에 의한 복귀돌연변이 유발성 여부를 측정하는 방법이다. 인공적으로 유발한 돌연변이체인 히스티딘 영양요구주를 히스티딘이 없는 배지에서 배양하고, 이 때 여러 돌연변이원(mutagen)이라 여겨지는 물질을 첨가하여 배양하면, back mutation에 의해 생기는 revertant만 살아남게 된다. 이렇게 생성되는 colony를 자연적으로 유발되는 revertant colony와 비교하여 mutation 여부를 판단하는 방법이다. 본 연구에서 돌연변이 유발성(mutagenicity)은 구조 이동 계열(frame shift type) 중에서 TA98 균주와 염기쌍 치환 계열(base substitution type) 중에서 TA1535 균주를 선택하여, 5단계의 용량에서 매 용량 당 3매의 plate를 사용하여 대사활성화를 부여한 경우 (대사 활성법) 및 부여 하지 않은 경우 (직접법)의 양자에 대하여 전배양법(pro-incubation method)을 사용하여 박테리아 복귀 돌연변이 실험(Ames test)으로 평가 하였다. 복귀변이 집락 수(revertant colony)는 3개의 plate 평균치로 나타내었고, 돌연변이 유발성은 실험적으로 유발된 복귀 돌연변이의 수와 자발 복귀 돌연변이의 수의 비교로 평가된다. 시험물질은 적어도 한 농도에서 음성대조군에 비해 TA98의 경우 2배 이상, TA1535의 경우 3배 이상 복귀변이 집락수를 나타내었으며 또한 용량 의존성이 관찰되면서 재현성 있게 증가되었을 때, 돌연변이 유발성이 있다고 판단하였다. 음성대조물질은 용매인 멸균 3차증류수나 DMSO를 사용하였고, 양성대조물질은 사용한 균주의 유전학적 특성 및 대사 활성법의 적용 여부에 따라 sodium azide, 2-aminofluorene, 2-nitrofluo rene을 사용하였다. 또한 3회 반복시험을 통해 시험결과의 재현성을 확인하였다. 본 연구에서는 이미 알려진 유형별 유전독성 물질들을 대상으로 의약품 등의 독성시험기준 및 OECD 가이드라인으로 제시된 유전독성시험법인 복귀돌연변이시험(Ames test)에 대한 타당성(validation)을 검증하고 유전독성(genotoxicity)과 발암성(carcinogenicity)의 상관관계에 관하여 알아보고자 하였다. 유전독성 발암물질로서 1,2-dibromoethane과 glycidol, 유전독성 비 발암물질로서 8-hydroxy quinoline과 emodin, 비 유전독성 발암물질로서 methycarbamate와 o-nitrotoluene, 비 유전독성 비 발암물질로서 D-mannitol과 1,2- dichlorobenzene, 총 8 종의 시험물질을 선정하여 박테리아 복귀돌연변이 시험법의 타당성을 검증하였다. 본 연구에 사용된 살모넬라 TA98, TA1535는 음성대조군에서 자발복귀돌연변이율(spontaneous revertant colony, 콜로니수/plate)이 각각 22.67-32.67 범위와 16.67-24.67 범위로 나타나 해당 균주가 적합함을 확인하였다. 양성대조물질은 직접법과 S9 혼합액을 첨가한 대사 활성화법 모두에서 각각의 시험용 균주에 대하여 복귀변이 집락수를 증가시켜 본 시험이 적정하게 시행되어 졌음을 확인하였다. 적합성이 확인된 TA98과 TA1535 균주를 대상으로 8종 시험물질을 시험한 결과, 1,2-dibromoethane과 glycidol은 TA98 균주에서 대사활성 부재 시와 대사활성 존재 시 최고 농도에서 음성대조군에 비해 2 배 이상의 복귀변이 집락수가 관찰되었고 농도 의존적으로 복귀변이 집락수가 증가하였다. Emodin은 TA98 균주에서 대사활성 부재 시와 대사활성 존재 시 모두에서 음성대조군에 비해 2 배 이상의 복귀변이 집락수가 관찰되지 않았고 TA1535 균주에서 대사활성 부재 시 음성대조군에 비해 3 배 이상의 복귀변이 집락수가 관찰되지 않았고 대사활성 존재 시 음성대조군의 3 배 이상의 복귀변이 집락수가 관찰되었고 농도의존적인 돌연변이 증가가 일어났다. 8-hydroxyquinoline, methylcarbamate, o-nitrotoluene, D- mannitol, 1,2-dichlorobenzene은 TA98과 TA1535에서 대사활성 부재 시와 존재 시 모두에서 음성대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내지 않았다. 결론적으로1,2-dibromoethane과 glycidol은 복귀돌연변이 유발 능 (변이원성) 양성으로 판정되었고 Emodin은 TA1535 균주에서만 복귀돌연변이 유발 능 양성으로, 8- hydroxyquinoline, methylcarbamate, o-nitrotoluene, D-mannitol, 1,2-dichloro benzene의 경우는 복귀돌연변이 유발 능 음성으로 판정되었다. 4종의 발암물질 중에서 변이원성 양성으로 판정된 것은 1,2-dibromoethane과 glycidol로서 그 비율은 50%였고, 4종의 비 발암물질 중에서 변이원성 음성으로 판정된 것은 8-hydroxyquinoline, D-mannitol, 1,2dichlorobenzene으로 그 비율은 75%로 나타났다. 또한 3회 반복시험을 통해 시험결과의 재현성을 확인하였다. 이상의 결과로 Ames test의 민감도, 정확도, 재현성, 특이성 등이 검증되었다.;The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay (Salmonella test; Ames test) is a short-term bacterial reverse mutation assay specifically designed to detect a wide range of chemical substances that can produce genetic damage that leads to gene mutations. The test employs several histidine dependent Salmonella strains each carrying different mutations in various genes in the histidine operon. These mutations act as hot spots for mutagens that cause DNA damage via different mechanisms. When the Salmonella tester strains are grown on a minimal media agar plate containing a trace of histidine, only those bacteria that revert to histidine independence (his+) are able to form colonies. The number of spontaneously induced revertant colonies per plate is relatively constant. However, when a mutagen is added to the plate, the number of revertant colonies per plate is increased, usually in a dose-related manner. The Ames test is used world-wide as an initial screen to determine the mutagenic potential of new chemicals and drugs. The test is also used for submission of data to regulatory agencies for registration or acceptance of many chemicals, including drugs and biocides. International guidelines have been developed for use by corporations and testing laboratories to ensure uniformity of testing procedures. We have chose 1,2-dibromoethane, glycidol as genotoxic carcinogen, 8-hydroxyquinoline, emodin as genotoxic non-carcinogen, methyl carbamate, o-nitrotoluene as non-genotoxic carcinogen and D-mannitol, 1,2- dichlorobenzene as non-genotoxic non-carcinogen for the Ames test. In order to do validation of these genotoxic test methods, we have repeated each experiment at least three times and also tested cytotoxicity of each chemicals to find out appropriate concentration of each chemical for the each genotoxic test method. Positive control substance increased the formation of revertant colonies for each strain with or without S9 mix, compared with a negative control, which shows that this experiment was properly conducted. In the case of 1,2-dibromoethane and glycidol, revertant colonies increased in a concentration-dependent way for each strain with or without S9 mix, compared with a negetive control. In the case of emodin, revertant colonies increased in a concentration-dependent way for TA1535 strain with S9 mix, did not show a significant increase for TA98 with or without S9 mix and TA1535 without S9 mix, compared with a negetive control. 8-Hydroxyquinoline, methyl carbamate, o-nitrotoluene, D-mannitol, and 1,2-dichlorobenzene did not show a significant increase for each strain with or without S9 mix, compared with a negetive control. The above-mentioned results decided that 1,2-dibromoethane, glycidol and emodin are mutagenicity positive, and 8-hydroxyquinoline, methyl carbamate, o-nitrotoluene, D-mannitol, and 1,2-dichlorobenzene are mutagenicity negative.