간독성 유발물질인 acetaminophen 을 처리한 정상 간세포와 SV40-형질전환 간세포의 유전자 발현 비교

Abstract

It has been reported that SV40-transformed mouse cells exhibited the differences in morphological characteristics and antioxidative enzymes compared to its normal counterpart. These two cell lines might elicit different profiles in gene expression when exposed to toxic chemicals, and thus this could be utilized for understanding the mechanism of chemical toxicity and cancer chemotherapy. In this study, we investigated gene expression profiles in normal liver cell line(BNL CL. 2) and its SV40-transformed counterpart(BNL SV A. 8) treated with acetaminophen(APAP) using oligonucleotide chip. When assessed for finding dose and checking sensitivity by MTS and LDH assay, these two cell lines represented different susceptibility to APAP in a broad concentration range(0~5000μM). Based on the results, the treatment of concentrations of APAP was set with 625μM as a high concentration and 62.5 μM as a low, and treated for 24 hrs. Total RNAs were extracted and hybridized with oligonucleotide chip in three independent experiments. The analyses of chip data were performed by AVADIS software and annotated by DAVID and PANTHER. As a result, the treatment of high concentration did not change any significant differentially expressed genes(DEGs) in normal cell lines, but up-regulated genes such as p53, MAPK and apoptosis-relating genes were altered in transformed cells. When compared in two cell lines, genes up-regulated in normal cells and down-regulated in transformed cells were related to cell adhesion, detoxification, anti-apoptosis and catalytic activity. Genes down-regulated in normal cells and up-regulated in transformed cells were associated with immune response, response to stress, inflammatory response and apoptosis-related genes. Further, the expression seemed to be associated with both SV40 transformation and APAP treatment since those genes were differentially expressed when compared to normal cells even without APAP treatment, but continuously and also increasingly expressed in an APAP dose-dependent manner. In addition, we used real time RT-PCR to confirm selected genes significantly. At a result, the genes were confirmed significantly in DNA level. In conclusion, we found that SV40-transformed BNL SV A. 8 cells are more susceptible than normal counterpart to APAP treatment, and the underlying mechanism could be associated with immune response, response to stress, apoptosis, MAPK and cell death-related pathway.;Acetaminophen(APAP)은 대표적인 해열제, 진통제이지만 과복용시 간독성을 일으키는 약물이다. APAP가 간독성을 일으키는 기본적인 요인은 APAP과복용으로 인해 항산화 효소인 glutathione(GSH)을 고갈시켜 간세포 괴사를 일으키게 하는 것이다. 보고된 논문에 의하면, 정상 세포보다 Simian virus(SV)40-형질전환 세포가 GSH가 낮다는 연구결과가 있었다. 이런 연구결과들을 바탕으로 정상 간세포와 SV40-형질전환 간세포에 APAP를 처리하면 두 세포는 APAP에 대한 독성 감수성 차이를 보일 것으로 예상되어 이러한 독성 감수성 차이가 어떻게 일어나는지를microarray기술로 규명하고자 본 연구를 수행하게 되었다. 먼저 두 세포의 기본적인 형태 및 성장시간을 측정한 결과, 정상 간세포는 1차원적으로 자라면서 contact inhibition을 보였고, SV40-형질전환 간세포는 뭉쳐서 빨리 자라는 형태로 자라서SV40-형질전환 간세포가 정상 간세포보다 4시간 정도 빠르게 성장함을 확인하였다. 그 다음 APAP에 대한 두 세포의 감수성 차이를 비교해 본 결과, SV40-형질전환 간세포가 정상 간세포보다 APAP에 대한 세포 생존력이 약하고 독성이 나타나기 시작하는 APAP농도가 낮은 것으로 보아 APAP에 대한 감수성이 크다는 것을 확인하였다. 이 결과들을 바탕으로 APAP농도를 설정한 후, 유전자 발현 양상을 보기 위해 microarray를 수행하였다. 실험결과, 정상 간세포에서는 증가하고 SV40-형질전환 간세포에서는 감소하는 유전자들은 해독작용, 세포부착, 항염증 작용에 관련되었고1, 정상 간세포에서는 감소하고 SV40-형질전환 간세포에서는 증가하는 유전자들은 면역기능, 스트레스 및 약물에 대한 반응, 염증작용에 관련된 것들이었다. 위의 결과는 정상 간세포의 경우에는 크게 APAP 농도 의존적이지 않지만 SV40-형질전환 간세포의 경우에는 APAP 농도 의존적인 반응이 많았다. 또한 정상 간세포에서는 APAP 농도에 따라 유의하게 증감하는 유전자들은 거의 없었지만 SV40-형질전환 간세포에서는 APAP 농도에 따라 세포죽음, apoptosis, mitogen-activity protein kinase(MAPK)을 지닌 pathway를 지닌 유전자들이 유의하게 증가하였다. 이 중 가장 의미 있게 변화한 유전자들(junction adhesion molecule 4, DNA segment, chemokine ligand 17, suppressor of cytokine signaling 2, sestrin 2, dual specificity phosphatase 1, cyclin-dependent kinase inhibitor 1a, annexin a10)은 real time reverse transcription polymerase chain reaction(real time RT-PCR)을 이용하여 유전자 발현 양상을 확인하였다. 이상의 결과를 정리하면, SV40-형질전환 간세포는 정상 간세포에 비해 APAP의 낮은 농도에서 독성을 나타내었으며, 기전규명을 위한 microarray 분석결과, SV40-형질전환 간세포가 정상 간세포보다 면역기능, 염증작용, 스트레스 및 약물에 대한 반응에 관련된 유전자의 발현이 많고, 항산화 효소, 해독작용에 관련된 유전자의 발현이 적어 APAP에 대한 감수성이 높고 독성을 빨리 일으킨다고 할 수 있겠다.