PLACONTM방법으로 제조한 혈소판 풍부혈장(PRP)내 성장인자에 관한 정량적 연구

Abstract

자가 성장인자의 공급원으로 혈소판 풍부혈장 (platelet rich plasma, PRP)이 골질 및 골 형성 속도를 증가시킨다는 보고 이후, 임상에서 PRP가 많이 사용되어져 왔고, 국내에서도 PLACON^(TM)system(Oscotec.co., Korea)으로 제조한 PRP가 사용되고 있으나, 성장인자함량에 대한 기본 자료 및 연구가 부족하다. 이에 칼슘과 트롬빈을 첨가하기 전후의 성장인자 농도를 전혈과 PRP로 나누어 측정, 비교함으로서 PLACON^(TM)system으로 제작된 PRP의 효율을 규명하고자 하였다. 혈액은 26세부터 30세까지의 건강한 지원자 4명 (남2, 여2)에서 채취하여 PLACON^(TM)(Oscotec, Korea)의 제조사 프로토콜에 따라 제작 되었고 칼슘(Calcium chloride, sigma Co.,USA)과 트롬빈(thrombin 1000unit)으로 활성화 하였다. 성장인자 중 Platelet-derived growth factor-(PDGF)AB와 PDGF-BB및 transforming growth factor β(TGF-β)를 측정하였으며, 정량은 Duoset ELISA Development kit (R&D system, Minneapolis, USA)로 시행하였다. 연구결과 혈소판 풍부 혈장의 혈소판 수치는 전혈의 혈소판 수치에 비해 평균 약 4.36배 농축되어 유효한 혈소판 풍부 혈장을 얻을 수 있었다(p<0.05). 트롬빈을 첨가하여 활성화하기 전의 PDGF-AB 값은 전혈보다 PRP에서 약 7.5배 증가를 보였고, 트롬빈 첨가 후에는 전혈보다 PRP에서 약 5배 증가됨을 보였다(p<0.05). PDGF-BB의 경우, 트롬빈을 첨가하기 전에는 전혈보다 PRP에서 약 9.6배 증가됨을 보였고, 활성 후에는 전혈보다 PRP에서 약 6배 증가됨을 보였다(p<0.05). TGF-β는 트롬빈을 첨가하여 활성화기 전에는 전혈보다 PRP에서 약 2.37배 증가됨을 보였으나 통계적 유의성은 없었고, 트롬빈 첨가하여 활성화 한 후에는 전혈보다 PRP에서 약 3.74배 증가됨을 보였다(p<0.05). 혈소판 풍부 혈장을 제작하는 과정 중에 트롬빈을 첨가하지 않은 시료와 트롬빈을 첨가한 시료 간 PDGF-AB, PDGF-BB, TGF-β의 양은 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 연구결론 1. PLACON^(TM)system으로 PRP를 수집했을 때 전혈과 비교하여 4.36배 의 혈소판 농축율을 보였다. (p<0.05) 2. PRP 내에서 측정된 PDGF-AB, PDGF-BB은 전혈보다 통계학적으로 유의성 있게 높은 500%에서 960%의 증가를 얻었다. 3. 트롬빈을 첨가하여 활성화하기 전과 활성화 후의 혈소판 풍부 혈장내의 PDGF-AB, PDGF-BB및 TGF-β이 양의 차이는 통계학적인 유의성이 없었다(p>0.05).;The aim of this study was to evaluate the concentration of growth factors released from Platelt-Rich-Plasma(PRP) and whole blood before and after the addition of calcium and thrombin. To qualify the PRP preparation process of PLACON^(TM)system (Oscotec, Korea), platelet counts and concentration of growth factors from whole blood and PRPs were measured. Whole blood was drawn from 4 healthy donors (2 females, 2 males) aged 26 to 30 years. PRP was prepared from each donor's blood using PLACON^(TM)system (Oscotec, Korea) and activated with calcium and thrombin. Commercially available enzyme-linked immuno-sorbent assay kits were used according to the manufacturer's instructions to quantify the concentrations of growth factors. Platelet-derived growth factor (PDGF)AB, BB and transforming growth factor β(TGF-β) levels were measured by Duoset ELISA Development kit (R&D system Inc.,USA) The following results were obtained as 1) The platelet counts detected as 207.5 x 10³/㎕ in whole blood, while 905 x 10³/㎕ in PRP. 2) PDGF-AB concentration detected before addition of calcium and thrombin was 5.90 ± 1.08 ng/mL in whole blood, while 44.1 ± 1.9ng/mL in PRP. After addition of calcium and thrombin, PDGF-AB concentration detected was 9.99 ± 0.93 ng/mL in whole blood versus 51.3 ± 2.83 ng/mL in PRP. 3) PDGF-BB concentrations detected before addition of calcium and thrombin was 3.88 ± 0.18 ng/mL in whole blood versus 37.23 ± 1.11 ng/mL in PRP. After addition of calcium and thrombin, PDGF-BB concentrations detected was 5.90 ± 0.45 ng/mL in whole blood versus 35.35 ± 1.04 ng/mL in PRP. 4) TGF-β concentrations detected before addition of calcium and thrombin was 51.5 ± 0.92 ng/mL in whole blood versus 122.1 ± 2.4 ng/mL in PRP. After addition of calcium and thrombin, TGF-β concentrations detected was 30.7 ± 0.72 ng/mL in whole blood versus 114.9 ± 2.28 ng/mL in PRP. Therefore, it can be concluded that PRP contained significantly higher platelet counts compared with whole blood. (436%)(p<0.05) and Growth factor concentrations detected in PRP was significantly greater in 960% / 237% in Whole blood. The administration of thrombin for PRP activation resulted in the release of high concentrations of PDGF-AB, BB and TGF-β but only when PRP had not been activated during the preparation process in vitro.