당합성 유전자 발현용 이종숙주 제작 및 demethyllactenocin의 생합성

Abstract

본 논문은 방선균 Streptomyces venezuelae에서 TDP-6-D-allose를 생합성하여 OMT (5-O-mycaminosyl tylonolide)에 전이시켜 광범위한 동물의 호흡기 질병의 예방과 치료에 사용될 수 있는 폴리케타이드 (polyketide) 계열 항생제인 tylosin 유도체를 생산하기 위한 다양한 분자유전학 적인 방법에 관한 연구 결과이다. 본 연구의 목적은 tylosin 유도체 생산과 관련하여 당전이 효소의 기질 특이성을 알아보고 생합성 과정을 규명함에 있다. 본 연구에서 사용된 균주인 S. venezuelae는 다른 방선균들과 비교하여 2배 이상 빠른 성장속도를 가지고 있고 형질전환등의 유전자 조작이 매우 용이하며 유전자 치환 및 제거에 필요한 homologous 재조합을 통하여 double crossover 균주 선별이 가능하다. 또한 생리활성물질의 생합성 과정을 지배하는 생합성 유전자를 조작하여 천연물 유래 생리활성물질의 분자구조를 재구성하는 조합 생합성의 숙주로서 개발할 가치가 매우 높다. PKS에 의해 aglycone이 생합성 된 후 일어나는 post-PKS 변형 단계는 최적 생성되는 화합물에 생리활성을 가지게 하는데 필수적이다. 특히 aglycone에 첨가되는 deoxysugar부분은 생리활성물질이 대상 분자를 인식하는데 결정적인 역할을 한다. 본 연구에서는 OMT 화합물에 당을 전이 시키기 위하여 S. venezuelae의 pikromycin (pik) polyketide (PKS)와 desosamine (des) 유전자 집단이 삭제된 균주인 YJ028을 제작하였다. 이 균주에 TDP-D-quinovose를 생합성 하는 유전자 desIII, desIV와 당전이 효소를 클로닝한 플라스미드와 이 플라스미드에 tylMIII를 추가로 도입하여 만든 플라스미드 발현하여 OMT feeding한 결과 quinovosyl OMT는 검출되지 않았다. 또한 이 균주에 TDP-D-6-deoxyallose를 생합성 하는 유전자 desIII, desIV, tylD, tylJ와 당전이 효소를 코딩한 tylN을 클로닝한 플라스미드와 이 플라스미드에 당전이 보조 효소로 알려져 있는 tylMIII를 추가로 도입하여 만든 플라스미드를 모두를 발현하여 OMT를 feeding한 결과 demethyllactenocin이 검출되었다. 이처럼 당전이 효소인 TylN이 TDP-D-6-deoxyallose에만 작용하여 OMT에 TDP-D-6-deoxyallose 당을 성공적으로 전이 시킨 것으로서 TylN의 기질 특이성이 높다는 것을 알 수 있었다. 그리고 당전이 보조효소 없이 당전이 효소 TylN이 단독으로 원활한 당전이 반응을 수행할 수 있다는 것을 최초로 확인하였으며, 생합성된 TDP-D-6-deoxyallose가 OMT에 전이되어 demethyllactenocin이 생산됨으로써 6-deoxy-D-allose가 생합성 되는 경로를 확인하였다.;To develop a system for combinatorial biosynthesis of glycosylated macrolides, Streptomyces venezuelae was genetically manipulated to be deficient in the production of its macrolide antibiotics by deletion of the entire biosynthetic gene cluster encoding the pikromycin polyketide synthases and desosamine biosynthetic enzymes. The resulting strain was designated YJ028. To examine the flexibility of TylN toward non-native deoxysugar, TDP-D-quinovose, as well as the function of the second protein TylMIII, TDP-D-quinovose or proposed TDP-D-6-deoxyallose biosynthetic pathway together with glycosyltransferase TylN were expressed. The plasmid pYJ642 contains three genes (desIII, desIV, tylN) involved in the biosynthesis and the transfer of quinovose. The tylMIII gene was additionally transferred to the plasmid pYJ642 to generate pYJ643. These plasmids were transformed into the mutant YJ028 to generate YJ028/pYJ642 and YJ028/YJ643. The growing medium of those mutant strains were supplemented with OMT and the resulting broths were extracted. Quinovosyl derivative of OMT was not observed in the analysis of YJ028/pYJ642 and YJ028/pYJ643. The expression of quinovose pathway in conjunction with TylN (YJ028/pYJ642) resulted in the failure to generate quinovosyl OMT, showing the substrate specificity of TylN glycosyltransferase especially toward TDP-D-quinovose. In order to endow the structural diversity to tylosin analog by modification of C-23 position of tylactone, and identify the biosynthetic pathway of 6-deoxyallose as a part of tylosin formation in S. fradiae, proposed 6-deoxyallose biosynthetic pathway was expressed. The plasmid pYJ644 containing five genes (tylD, tylJ, tylN, desIII, desIV) responsible for the biosynthesis and transfer of 6-deoxyallose was constructed. The tylMIII gene was additionally transferred to the plasmid pYJ644 to generate pYJ645, respectively. These plasmids were transformed into the mutant YJ028 to generate YJ028/YJ644, and YJ028/YJ645 respectively. The growing medium of those mutant strains were supplemented with OMT and the resulting broths were extracted. 6-deoxyallose derivatives of OMT were detected in the analysis of YJ028/pYJ644 and YJ028/pYJ645. Demethyllactenocin was successfully biosynthesized by YJ028/pYJ644 fed with OMT, showing that introduction of tylJ and tylD together with desIII and desVI (generating 4-keto-6-deoxy-D-glucose) was sufficient for the biosynthesis of 6-deoxyallose.