Biotransformation of phospholipids and fatty acids and enzymatic application of liposome engineering

Abstract

Lipids are one of the most abundant biomasses and used extensively as substrates and precursors for the synthesis of biologically active molecules. In this study, the biotransformation of phospholipids and fatty acids have been focused on and the reaction products were applied for engineering of the lecithin-based liposomes. The biotransformation of soy lecithin liposomes was conducted by using the phospholipase A2 from Streptomyces violaceoruber (Sv-PLA2) to produce lysolecithin liposomes containing free fatty acids (e.g., linoleic acid and oleic acid). The resulting fatty acids loaded in the lysolecithin liposomes were transformed into various fatty acid derivatives such as hydroxy fatty acids (e.g., 10-hydroxy-12-octadecenoic acid and 10-hydroxystearic acid), hydrocarbons (e.g., 6,9-heptadecadiene and 8-heptadecene), and secondary fatty alcohols (e.g., 9-hydroxy-11-heptadecene and 9-hepadecanol) by using a fatty acids double bond hydratase from Stenotrophomonas maltophilia (Sm-OhyA2), and/or a photoactivated decarboxylase from Chlorella varilabilis NC64A (Cv-FAP). The lysolecithin liposomes containing the fatty acid derivatives could be used as active ingredients and for liposome engineering. The lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa (Pa-LOX) was investigated to understand the reaction mechanisms, in particular the factors to determine the positional specificity of the enzyme for C13 and C9 oxygenation of linoleic acid. The linoleic acid biotransformation and crystal structure-based modeling of enzyme-substrate complex suggested that the positional specificity of Pa-LOX might depend on the geometry of the hydrocarbon tail-binding cavity. Notably, the mutation of Y609G and M434G of Pa-LOX allowed to convert arachidonic acid to 8-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (8-HPETE) and 11-HPETE, respectively, instead of 15-HPETE. This result indicated that geometry of the substrate-binding cavity, especially the geometry of the hydrocarbon tail-binding cavity played a key role in the positional specificity of Pa-LOX for not only for linoleic acid but also arachidonic acid. Finally, the lysolecithin liposomes containing the free fatty acids (e.g., linoleic and oleic acids) were investigated as antimicrobial agents to suppress the growth of a notorious keystone periodontal pathogen, Porphyromonas gingivalis. The antibacterial activities of the liposomal fatty acids were comparable to those of free-form linoleic acid in a simple aqueous system with minimum inhibitory concentration (MIC) of 4.8 μg/mL. Their antibacterial activities, however, in the presence of milk and milk alternatives were significantly stronger (MIC, 35 μg/mL) than those of free-form linoleic acid (MIC, 100 μg/mL). The higher antibacterial activities of the liposomal fatty acids might be due to efficient delivery of the antibacterial fatty acids from the liposomes to P. gingivalis even in the presence of emulsified fat globules and protein micelles. These results indicated that the lysolecithin liposomes including the free fatty acids may serve as antibacterial agents to suppress the growth of P. gingivalis not only in a simple aqueous system but also in the presence of complex food components. This study overall demonstrated that not only phospholipids but also free fatty acids could be enzymatically functionalized. The substrate-binding cavity engineering of fatty acid biotransformation enzymes may allow to enlarge application of fatty acids. In addition, the lysolecithin liposomes may serve as an excellent nano-scale delivery system of multi-functional free fatty acids to targets in complex food systems.;효소를 이용한 인지질과 지방산의 생물학적 변환은 다양한 지방산 유도체를 포함하는 고부가가치 인지질 리포좀을 생산하는 데 도움이 된다. 이 연구는 포스포리파제 A2, 수화효소, 탈탄산효소 및/또는 리폭시게나아제를 사용하여 기능화된 인지질과 지방산을 생산하고 적용하는 연구를 진행하였다. 연구 2에서는 레시틴 고부가가치화를 위해서 포스포리파제 A2를 이용하여 레시틴 리포좀으로부터 지방산이 실린 라이소레시틴 리포좀을 생성하였다. 또한 라이소레시틴 리포좀에 실려있는 지방산을 다양한 지방산 유도체로 바꾸기 위해 Stenotrophomonas maltophilia에서 유래한 지방산 이중 결합 수화효소와 Chlorella variabilis NC64A에서 유래한 광활성 탈탄산효소를 이용하여 하이드록시 지방산, 탄화수소, 그리고 2차 지방 알코올이 실린 라이소레시틴 리포좀을 생성하였다. 연구 3에서는 좀 더 다양한 지방산 유도체를 생성하기 위해 Pseudomonas aeruginosa에서 유래한 리폭시게나아제의 기질 터널 엔지니어링을 실시하고, 이를 적용한 전세포 생물전환 반응 시스템을 구축하였다. 기질 도킹 시뮬레이션을 이용한 기질 터널 확장을 한 돌연변이 리폭시게나아제 (예: Y609G 혹은 M434G)는 아라키돈산으로부터 새로운 위치에 하이드로퍼옥시 잔기를 가진 지방산 (예: 8-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (8-HPETE) 및 11-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (11-HPETE))을 생성할 수 있었다. 연구 4에서는 지방산을 포함한 라이소레시틴 리포좀을 치주균인 Porphyromonas gingivalis에 대한 항균제로서의 응용하는 실험이 진행되었다. 리놀레산과 올레산을 지닌 라이소레시틴 리포좀은 수용액 상에서 자유롭게 분산되어 있는 리놀레산과 비슷한 항균효과를 보였다. 하지만 라이소레시틴 리포좀에 포함된 지방산은 항균 활성을 방해할 수 있는 물질이 포함된 우유 및 우유 대체제가 포함된 조건 하에서 P. gingivalis의 성장을 더 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 이러한 효소 기반의 리포좀 엔지니어링 전략은 가격이 저렴한 레시틴으로부터 고부가가치 인지질과 지방산을 가진 리포좀을 생산하는 새로운 전략을 제시하고 이를 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 활용할 수 있는 기반을 마련할 수 있을 것으로 기대된다.