Structure modeling-based characterization and engineering of ChnD, the 6-hydroxyhexanoate dehydrogenase from Acinetobacter sp. NCIMB 9871

Abstract

α,ω-Dicarboxylic acids, ω-aminoalkanoic acids, and α,ω-diaminoalkanes are widely used as building blocks for the production of biopolyesters and biopolyamides. One of the key steps in producing these chemicals is oxidation of ω-hydroxycarboxylic acids using alcohol dehydrogenases (e.g., ChnD of Acinetobacter sp. NCIMB 9871). However, the enzymatic reaction and structural characteristics of these enzymes have remained largely unexplored. Therefore, this study focused on characterizing ChnD through enzyme kinetics, structure modeling, and substrate-docking simulations. ChnD showed the highest activity for 12-hydroxydodecanoic acid, displaying a catalytic efficiency of 17.23 s-1∙mM-1 among ω-hydroxycarboxylic acids (C6 – C12). This high catalytic efficiency was attributed to positive interactions between the carboxyl group of the substrates and the amine group of Arg62 located in the substrate binding region. By integrating the results of kinetic experiments, tunnel analysis, and docking simulations, Arg62, was identified as an engineering target, and replaced by leucine. Consequently, I obtained a variant with increased catalytic efficiency for fatty alcohols (i.e., C6 – C10) and branched chain alcohol (i.e., 3-methyl-2-buten-1-ol). Furthermore, the enhanced activity of ChnD_R62L in the biosynthesis of 3-methyl-2-butenoic acid was confirmed. This study will contribute to the deeper understanding of medium-chain primary aliphatic alcohol dehydrogenases, and their applications in the production of industrially relevant chemicals such as α,ω-dicarboxylic acids, ω-aminoalkanoic acids, and α,ω-diaminoalkanes, and from renewable biomass.;알파, 오메가-디카르복실산, 오메가-아미노알카노익산, 알파, 오메가-디아미노알케인은 바이오 폴리에스터와 바이오 폴리아마이드를 합성하는데 중요한 구조 단위로 활용된다. 이러한 화합물의 생산에서는 오메가-하이드록시카르복실산의 산화가 중요한데, 이 과정에서 Acinetobacter sp. NCIMB 9871 에서 유래한 6-하이드록시헥사노에이트 탈수소효소인 ChnD와 같은 알코올 탈수소효소가 사용될 수 있다. 하지만, 해당 효소에 대한 효소적 반응과 구조적 특성은 대체적으로 연구가 부족한 상황이다. 따라서 본 연구는 효소 키네틱스 측정, 구조 모델링, 기질-도킹 시뮬레이션을 통해 ChnD의 특성을 분석하는데 초점을 맞췄다. ChnD는 키네틱을 측정한 오메가-하이드록시카르복실산 (C6-C12) 중 12-하이드록시도데카노익산에서 17.23 s-1∙mM-1의 가장 높은 촉매 효율을 보였다. 이러한 높은 촉매 효율은 기질의 카르복실기와 기질 결합 부위에 위치한 Arg62의 아민기의 상호 작용이 영향을 미쳤다. 키네틱 측정 실험, 터널 분석, 도킹 시뮬레이션의 결과를 종합하여 Arg62가 엔지니어링 타겟 잔기로 선정되었고, 루신으로 대체되었다. 결과적으로, 지방 알코올 (C6-C10)과 3-메틸-2-부텐-1-올과 같은 분기 사슬 알코올에 대한 촉매 효율이 증가한 ChnD_R62L 변이체를 얻을 수 있었다. 더 나아가, ChnD_R62L은 3-메틸-2-부텐산의 생합성 과정에서도 향상된 활성을 보이는 것이 입증되었다. 본 연구는 중쇄 지방족 일차 알코올 탈수소효소들에 대한 심층적 이해와, 해당 효소들이 재생가능한 바이오매스로부터 생산될 수 있는 알파, 오메가-디카르복실산, 오메가-아미노알카노익산, 알파, 오메가-디아미노알케인과 같은 산업적으로 중요한 화합물들의 생산에 적용되는 방안을 제시한다.