Anti-inflammatory and neuroprotective mechanisms of necroptosis inhibitors in neuroinflammation and Parkinson’s disease mouse models

Abstract

Ⅰ. The role of RIPK1 in LPS-induced neuroinflammation and MPTPinduced Parkinson’s disease (PD) mouse model. In the first part of this study, I explored the role of receptor interacting protein kinase 1 (RIPK1), an initiator of necroptosis, in lipopolysaccharide (LPS)-induced neuroinflammation and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced Parkinson’s disease model mice by using RIPK1-specific inhibitors, necrostatin-1 (Nec-1) and necrostatin-1 stable (Nec-1s). Nec-1 and Nec-1s or RIPK1 small interference RNA (siRNA) inhibited the production of proinflammatory molecules such as nitric oxide (NO), tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-6, while they increased anti-inflammatory IL-10 in LPS-induced inflammatory or LPS/QVD (caspase inhibitor)/BV6 (IAP inhibitor)-induced necroptotic conditions of BV2 microglial cells. In addition, Nec-1 and Nec-1s inhibited the phosphorylation of RIPK1-RIPK3- mixed lineage kinase domain like pseudokinase (MLKL), cell death and the release and/or expression of damage associated molecular patterns (DAMPs) in LPS or LPS/QVD/BV6-stimulated BV2 cells. Detailed mechanistic studies showed that Nec-1 and Nec-1s exerted anti-inflammatory effects by modulating adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK), phosphoinositol-3-kinase (PI3K)/ protein kinase B (PKB; Akt), mitogen-activated protein kinase (MAPKs), and nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathways, and antioxidant effects by modulating nuclear factor-erythroid 2-related factor (Nrf2)/ antioxidant response element (ARE) and cAMP response element-binding protein (CREB) signaling pathways in LPS-stimulated BV2 cells. The anti-neuroinflammatory effects of RIPK1 inhibitors were confirmed using in vivo models. The Nec-1 and Nec-1s inhibited microglial activation and proinflammatory gene expression by inhibiting the RIPK1 phosphorylation (p-RIPK1) in the brains of LPS-injected systemic inflammation mice model. In addition, Nec-1 and Nec-1s exerted neuroprotective and anti-inflammatory effects in MPTP-induced PD mice. I found that p-RIPK1 is mainly expressed in microglia, and thus RIPK1 may contribute to neuroinflammation and subsequent cell death of dopaminergic neurons in MPTP-induced PD model mice. These data suggest that RIPK1 is a key regulator of microglial activation in LPS-induced neuroinflammation and MPTP-induced PD mice. Ⅱ. The role of MLKL in LPS- or poly(I:C)-induced neuroinflammation and MPTP-induced PD mouse model. In the second part, I explored the role of MLKL, a final executor of necroptosis, in LPS- or polyinosinic: polycytidylic acid (poly(I:C))-induced neuroinflammation and MPTP-induced PD mice model by using MLKL-specific inhibitor necrosulfonamide (NSA). NSA or MLKL siRNA inhibited the production NO and proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS- or poly(I:C)-induced inflammatory conditions and LPS/QVD/BV6- or poly(I:C)/QVD/BV6-induced necroptotic conditions of BV2 microglial cells. In addition, NSA inhibited the phosphorylation of RIPK1-RIPK3-MLKL, cell death and the release and/or expression of DAMPs (HMGB1, IL-1α/β and IL-33) in LPS- or poly(I:C)-induced inflammatory/necroptotic conditions. Detailed mechanistic studies showed that NSA has anti-inflammatory properties by inhibiting phosphorylated-ERK, -p38 MAPKs, NF-κB, interferon regulatory factor (IRF)1/7 and interferon (IFN)-β and upregulating Nrf2/ARE and CREB signaling pathways in LPS- or poly(I:C)-stimulated BV2 microglial cells. The anti-neuroinflammatory effects of NSA were confirmed using in vivo models. NSA inhibited microglial, astrocyte activation and proinflammatory gene expression in the brains of LPS- or poly(I:C)-injected mice. In addition, NSA exerted neuroprotective and anti-inflammatory effects in MPTP-induced PD mice. Interestingly, I found that phosphorylated-MLKL is expressed in microglia and dopaminergic neurons, and thus MLKL may contribute to neuroinflammation and dopaminergic neuronal cell death in MPTP-induced PD model mice. These data suggest that MLKL plays an important role in LPS-or poly(I:C)-induced neuroinflammation and MPTP-induced dopaminergic neuronal cell death. ;본 연구에서는 LPS 또는 poly(I:C)로 유도된 신경염증과 MPTP로 유도된 파킨슨병 마우스 모델에 네크롭토시스(necroptosis) 억제제를 주사하여 항염증 및 신경보호 효과와 이와 관련된 분자적 메커니즘을 규명하고자 하였다. 세포실험 (in vitro)에서는, LPS, poly(I:C) 또는 LPS/Q-VD-OPh(QVD)/BV-6(BV6), poly(I:C)/QVD/BV6를 처리하여 염증 및 네크롭토시스를 유발한 BV2 소교세포에서 RIPK1 억제제인 necrostatin-1(Nec-1), necrostatin-1-stable (Nec-1s) 및 necrosulfonamide (NSA)를 처리시 염증/항염증성 인자들의 발현에 미치는 영향을 ELISA, RT-PCR 및 western blot을 통해 조사하였다. 세포 독성은 LDH assay를 통해 평가되었다. 전사인자들의 활성에 미치는 영향은 EMSA, reporter gene assay 및 western blot을 통해 관찰하였다. 생체 내 (in vivo)에서는, LPS와 poly(I:C)로 유발한 신경염증 마우스 모델과 MPTP로 유발한 파킨슨병 마우스 모델을 이용하여 Nec-1, Nec-1s, NSA가 도파민 신경세포 사멸, 소교세포 활성, 염증성 마커 발현 등에 미치는 영향을 면역조직화학 및 면역형광 염색, western blot 및 RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 본 연구의 첫번째 파트에서는 BV2 소교세포에 LPS, LPS/QVD/BV6를 처리하여 유도된 염증 및 네크롭토시스 조건에서 RIPK1 저해제인 Nec-1, Nec-1s의 항염증효과와 기전을 분석하고 LPS 전신염증 및 MPTP 파킨슨병 마우스에서 그 효과를 검증하는 실험을 진행하였다. Nec-1, Nec-1s는 염증 및 네크롭토시스에 의해 유도되는 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 등 염증성 싸이토카인의 생성을 억제하고, 항염증성 사이토카인 IL-10의 생성은 증가시켰다. 이러한 결과는 RIPK1 siRNA를 이용한 유전자 녹다운 실험을 통해서 확인되었다. 또한 Nec-1과 Nec-1s는 LPS 또는 LPS/QVD/BV6로 자극된 BV2 소교세포에서 RIPK1-RIPK3-MLKL의 인산화 및 세포사멸, DAMPs (HMGB1, IL-33, IL-1α, IL-1β) 유전자 발현을 억제했다. 구체적인 메커니즘 연구에서, Nec-1과 Nec-1s는 AMPK, PI3K/Akt, MAPKs, NF-κB 신호전달 경로를 조절하여 항염증 효과를 나타내며, Nrf2/ARE 및 CREB 신호전달 경로를 조절하여 항산화 효과를 나타냄을 규명하였다. Nec-1과 Nec-1s는 LPS로 유도된 전신염증 마우스 뇌에서 RIPK1 인산화 억제를 통해 소교세포 활성화 및 염증성 유전자 발현을 억제했다. MPTP 유도된 파킨슨병 마우스 모델에서 Nec-1과 Nec-1s는 신경보호 및 항염증 효과를 나타냈다. MPTP 마우스에서 RIPK1 인산화는 소교세포에서 관찰되었으나, 도파민 신경세포에서는 관찰되지 않았으며, Nec-1과 Nec-1s에 의해 소교세포에서 RIPK1 인산화가 감소하였다. 이 결과는 소교세포에서 발현된 RIPK1 인산화가 염증을 유도하고 이를 통해 신경세포 사멸에 기여함을 시사한다. 본 연구의 두번째 파트에서는, BV2 소교세포에 LPS 또는 poly(I:C)로 유도한 염증 조건과 LPS/QVD/BV6 또는 poly(I:C)/QVD/BV6로 유도한 네크롭토시스 조건에서 MLKL 저해제인 NSA의 항염증 효과와 기전을 분석하고 전신염증 및 파킨슨병 마우스에서 그 효과를 검증하는 실험을 진행하였다. LPS 또는 poly(I:C)로 활성화된 BV2 소교세포에서 NSA는 Nec-1과 Nec-1s 보다 아주 낮은 농도에서 염증성 싸이토카인의 발현을 효과적으로 감소시킴을 발견하였다. NSA의 항염증 효과를 MLKL siRNA 실험을 통해 확인하였고, NSA는 RIPK1-RIPK3-MLKL의 인산화 및 세포사멸, DAMPs (HMGB1, IL-33, IL-1α, IL-1β) 유전자 발현을 억제했다. 구체적인 기전 분석을 통해 NSA가 LPS 또는 poly(I:C)에 의해 유도된 p-ERK/p38 MAPK, NF-κB, IRF1/7, IFN-β발현을 억제하고, Nrf2/ARE 및 CREB 신호전달 경로를 활성화함을 알 수 있었다. NSA는 LPS 또는 poly(I:C) 주사한 마우스의 뇌에서 소교세포/성상세포의 활성화 및 염증성 유전자 발현은 억제하고 항산화 효소 유전자 발현은 증가시켰으며, MPTP로 유도된 파킨슨병 마우스 모델에서 신경보호 및 항염증 효과를 나타냈다. MPTP 마우스의 뇌에서 MLKL의 인산화는 소교세포 및 도파민성 신경세포에서 모두 관찰되었으며 NSA에 의해 억제되었다. 이러한 결과는 MLKL이 신경염증 및 세포사멸에 공통적으로 기여할 가능성을 보여주고 있다. 본 연구들을 통해 신경염증 및 파킨슨병 마우스 모델에서 RIPK1 및 MLKL 억제제의 치료효과 및 작용기전을 규명하였다. 이러한 결과는 RIPK1 및 MLKL이 신경염증 및 세포사멸에 중요한 매개인자로 작용할 가능성을 나타내고 있다. 본 연구에서 규명한 Nec-1, Nec-1s와 NSA의 항염증 및 신경보호효과는 신경염증을 동반한 파킨슨병 및 기타 퇴행성 뇌질환에 잠재적인 치료 효과를 제시해 준다.