DNA nanocomplex-reinforced bioresponsive hydrogel as a versatile platform for efficient gene therapy

Abstract

Gene therapy allows for the fundamental treatment of diseases. There are two main methods for gene delivery: virus-based methods and non-viral vectors. While virus-based methods are extensively researched for their high gene delivery efficiency, they often trigger immune reactions, have high toxicity, and may induce mutations. Although AAV (Adeno associated virus), with reduced toxicity and immunogenicity, has been explored, it has limitations in carrying only small-sized DNA (≤4.7 kb) and faces challenges in production. On the other hand, non-viral delivery methods can accommodate genes and proteins of various sizes and allow for easy mass production. Among them, polyethylenimine (PEI) is a widely used gene delivery reagent known for its simplicity, cost-effectiveness, and effective transfection capabilities. Additionally, cell-penetrating peptides (CPPs) are short peptide sequences that enhance gene delivery efficiency by facilitating interaction with the cell membrane, allowing for intracellular penetration. Using hydrogels with high biocompatibility can significantly enhance the gene therapy effect. mPEG-PLGA is an amphiphilic copolymer with a temperature-sensitive property that forms a gel at body temperature. It allows easy 100% drug loading and exhibits a characteristic of sustained drug release for about 30 days, enabling a prolonged gene therapy effect. Moreover, its injectable property allows for localized treatment in specific areas. Especially in the case of degenerative joint diseases such as osteoarthritis, a symptom of aging, current treatments primarily focus on pain relief or temporary methods like surgery for artificial joint insertion. By applying our hydrogel-DNA dual delivery system in such scenarios, not only can the hydrogel injection enhance knee joint mobility, but the integrated genes can be delivered to surrounding cells over an extended period, potentially facilitating fundamental treatments such as cartilage regeneration or promotion of chondrocyte differentiation for diseases like osteoarthritis. During in vivo tests, it was found that the hydrogel-mediated delivery of genes resulted in longer and more intense fluorescence than in scenarios without the hydrogel. Furthermore, to broaden the application of this system as a versatile platform, we integrated the CRISPR/Cas9 gene editing system. Under the optimized DNA complex conditions, a gene editing efficiency of over 60% with CRISPR/Cas9 was confirmed. Therefore, the hydrogel-DNA dual delivery system can be applied as a spatiotemporally controllable versatile delivery platform, facilitating the fundamental treatment of various diseases.;유전자 치료는 질병의 근본적인 치료가 가능하며, 유전자를 전달하는 방법에는 크게 바이러스를 통한 방법과 비바이러스 벡터를 사용한 전달 방법이 있다. 바이러스 기반 방법이 높은 유전자 전달 효율로 많이 연구되고 있지만, 면역 반응이 많이 일어나고, 독성도 높으며 돌연변이를 발생하기도 한다. 독성과 면역반응을 낮춘 AAV(아데노 부속 바이러스)가 최근 연구되고 있긴 하지만, 이는 4.7 kb 이하의 작은 사이즈의 DNA만 탑재할 수 있어 유전자 전달에 한계가 있고 생산도 까다롭다. 하지만, 비바이러스 전달 방법은 크기 상관없이 유전자 및 단백질을 탑재할 수 있으며, 쉽게 대량 생산이 가능하다. 그 중 polyethyelenimine (PEI) 고분자는 이미 유전자 전달체로도 사용되고 있으며 이는 간단하고, 경제적이며, 효과적인 전사 효율제이다. 또한 cell penetrating peptides (CPPs, 세포 투과 펩타이드)는 짧은 서열의 펩타이드로, 세포막과의 상호작용을 통해 세포 내부 투과율을 높여 유전자 전달 효율을 높인다. 이때 높은 생체 적합성을 가진 하이드로젤을 사용하여 유전자 치료 효과를 훨씬 높일 수 있다. mPEG-PLGA는 양극성 고분자로, 체온에서 젤이 되는 온도 감응성을 가진다. 약물을 쉽게 100% 탑재할 수 있으며, 약 30일간 꾸준하게 약물을 방출하는 특성을 가지기 때문에 오랜 기간 유전자 치료 효과를 낼 수 있다. 또한 주사 가능한 물성으로 원하는 부위에 국소적인 치료가 가능하다. 특히 노화의 한 증상인 퇴행성 관절염의 경우, 아직까지 질병의 완전한 치료법 없이 통증을 완화하거나, 수술을 통한 인공관절 삽입 등 일시적인 방법만 진행되고 있다. 여기에 우리의 hydrogel-DNA dual delivery 시스템을 적용한다면, 하이드로젤 주사를 통해 무릎 관절 가동성도 높일 뿐만 아니라, 탑재된 유전자가 오랜 기간 주변의 세포로 전달되어 연골 재생이나 연골 세포 분화 촉진과 같은 질병의 근본적인 치료가 될 수 있다. 해당 시스템은 실제 in vivo 실험에서 하이드로젤에 유전자 복합체를 탑재하여 전달할 경우, 하이드로젤을 사용하지 않았을 때보다 오랜 기간 높은 형광을 발현하는 것을 확인했다. 추가로, 해당 시스템을 versatile platform으로 적용하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 접목해보았으며, 우리가 최적화한 DNA 복합체 조건에서 60% 이상의 CRISPR/Cas9의 유전자 편집 효율이 확인되었다. 따라서, 해당 hydrogel-DNA dual delivery system은 spatiotemporally 조절 가능한 versatile delivery platform으로, 다양한 질병의 근본적인 치료에 적용될 수 있다.