Active locomotion of diatom complex

Abstract

The objective of this study is to evaluate the efficacy of diatom complex with active micro-locomotion for removing biofilms from prosthetics, particularly dentures in the oral cavity. The research focused on evaluating the elimination of biofilm formed on 3D printed denture base resin by comparing two types of diatom complexes, with a commercially available denture cleanser and peracetic acid, which is commonly recommended for disinfecting dental instrument. In addition, alterations in the physical and mechanical properties and cytotoxicity of the denture resin material before and after cleansing process were evaluated. A total of 36 denture base resin specimens (Tera Harz TFD-23-5; Graphy, South Korea) were fabricated for this study. The specimens, in a roof shape (12  5  12 mm) were printed on a 3D printer (T7L-130; Veltz, South Korea). Pseudomonas aeruginosa was cultured on the denture base resin for 72 hours to facilitate the formation of biofilm. For the cleansing process, cleansing solutions were prepared and applied for 10 minutes. (1) phosphate-buffered saline (negative control, NC), (2) 3% H2O2 + peracetic acid (positive control, PC), (3) commercial denture cleanser (CDC) (Polident 5minutes Quick Plus; GlaxoSmithKline, Ireland), (4) 3% H2O2 + 2 mg/mL diatom complex M (DM), (5) 3% H2O2 +2 mg/mL diatom complex A (DA), and (6) CDC + 2 mg/mL DM. To assess the efficacy of biofilm removal quantitatively, the absorbance was measured at a wavelength of 550 nm after staining with 0.1% crystal violet. Additionally, immunostaining was conducted to visualize living bacteria (stained green) and extracellular polymeric substance (EPS) (stained red) and observed under a confocal laser scanning microscope (LSM700; ZEISS, Germany). To assess the impact of using DM and CDC over a stipulated period of 5 years, 40 specimens made of definitive 3D printing denture base resin material (NextDent Base; Vertex Dental, Soesterberg, Netherlands) were prepared. The evaluation focused on the physical and mechanical properties and cytotoxicity of the specimens before and after the cleansing process. The following parameters were measured and analyzed: Surface roughness was measured with a noncontact surface roughness meter (Contour GT-I; Bruker Nano Inc., USA), while ΔE was obtained using a spectrophotometer (CM-5 Spectrophotometer; Konica Minolta, Japan), surface micro-hardness was measured with a Vickers micro-hardness tester (MMT-X; Matsuzawa, Japan), flexural strength was evaluated with a universal testing machine (Instron 5942; Instron, Norwood, MA, USA), and cytotoxicity was evaluated using Cell Counting Kit (CCK)-8. All statistical analyses were conducted using SPSS for Window (SPSS version 29; IBM Corporation, Armonk, NY, USA) with one-way ANOVA, followed by Scheffe’s test as a post hoc (p < 0.05). The experimental results revealed notable differences in absorbance among the different groups. The group treated with 3% H2O2 + DA group demonstrated the lowest absorbance value (0.737 ± 0.267), followed by the 3% H2O2 + DM group (0.885 ± 0.248), PC group (1.750 ± 0.364), CDC group (2.515 ± 0.196), CDC + DM group (2.592 ± 0.398), and finally, the NC group (3.513 ± 0.293). Scheffe’s test was conducted to evaluate the significance of the difference in mean values in each group through multiple comparisons. Statistically significant differences were shown in all groups based on the NC group. DA and DM groups showed the largest mean difference, and there was no significant difference between two groups. Immunostaining analysis using a confocal laser scanning microscope showed minimal green staining in the 3% H2O2 + DM group, indicating a low presence of bacterial cells. Regarding the evaluation of physical and mechanical properties of denture base resin, no statistically significant differences were observed in surface roughness, micro-hardness, color, and flexural strength for DM before and after cleansing, while compared to the CDC group. In the cytotoxicity test, the relative cell count was over 70%, reflecting an absence of cytotoxicity. Therefore, it can be concluded that the biofilm removal ability of diatom complex utilizing active micro-locomotion is effective, and it is evaluated to have a comparable capability to commercially available denture cleansers. Additional research is needed to determine the optimal application conditions for achieving high cleansing efficacy. It is expected that diatom complex will be actively applied in the field of dentistry in the future. ;서론: 본 연구에서는 규조류에 이산화망간을 도핑하여 만든 규조류 복합체와 과산화수소를 반응시켰을 때 나타나는 active micro-locomotion이 가진 바이오 필름 제거 효과를, 3D 프린팅 의치상 레진에 바이오필름을 형성한 뒤 2종의 규조류 복합체와 시판되는 의치 세정제, 치과용 기구 소독에 사용하는 과초산과 세정하여 비교하였고, 세정 전후 의치상 레진의 물성 변화 및 세포 독성 평가를 시행하였다. 재료 및 방법: 지붕 모양(12 x 5 x 12mm)의 의치상 레진(Tera Harz TFD-23-5; Graphy, Korea) 시편 총 36개를 3D 프린터(T7L-130; Veltz, Korea)로 출력하였다. 그 위에 Peudomonas aeruginosa를 72시간동안 배양하여 바이오필름을 형성하고, 세정액으로는 (1) PBS (음성대조군), (2) 3% H2O2 + peracetic acid (양성대조군), (3) 시판용 의치 세정제 (Polident 5minutes quick plus, GlaxoSmithKline, Ireland), (4) 3% H2O2 + 규조류 복합체 Melosira (M), (5) 3% H2O2 + 규조류복합체 Auracoseira (A), (6) 의치 세정제 + 규조류 복합체 M을 준비하여 10분간 세정하였다. 바이오필름 제거 효과를 정량적으로 평가하기 위해 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, immunostaining하여 공초점 레이저 주사현미경(LSM700; ZEISS, Germany)으로 남아있는 바이오필름을 관찰하였다. 규조류 복합체와 시판 의치세정제로 5년간 세정한다는 가정하에, 세정 전후 물성변화 및 세포 독성 평가를 위해 각 40개의 시편을 의치상 레진(NextDent Base; Vertex Dental, Soesterberg, Netherlands)으로 제작한 뒤, 구조류 복합체는 12.6일, 의치세정제는 6.3일 동안 세정액 속에 담궈 두었다. 담금 처리 전후의 물성 변화 평가를 위해, 비접촉 표면거칠기 측정기(Contour GT-I; Bruker Nano Inc., USA)로 표면 거칠기를, 분광광도계(CM-5 Spectrophotometer; Konica Minolta, Japan)를 이용하여 색차를, 마이크로 비커스경도기(MMT-X; Matsuzawa, Japan)로 미세경도를, 만능재료시험기(Instron 5942; Instron, Norwood, USA)로 굴곡강도를 측정하였고, 세포 독성 평가는 CCK-8 assay로 시행하였다. 모든 통계분석은 SPSS(SPSS for Windows, Version 29.0; Armonk, NY, USA)를 이용하여 one-way ANOVA로 실시하였고 Schaffe’s test로 사후검정 하였다(p<0.05). 결과: 크리스탈 바이올렛 염색 흡광도 측정 결과, 3% H2O2 + 규조류 복합체 A (0.737 ± 0.267)가 가장 낮았고, 다음으로 3% H2O2 + 규조류복합체 M (0.885 ± 0.248), 양성대조군 (1.750 ± 0.364), 시판 의치 세정제 (2.515 ± 0.196), 의치 세정제 + 규조류 복합체 M (2.592±0.398), 음성대조군 (3.513 ±0.293)순으로 나타났다. 다중 비교를 통해 각 군들 평균값 차이에 대한 유의성을 평가하고자, Scheffe’s test를 시행한 결과, 규조류복합체 A와 M이 가장 낮은 평균값으로 바이오필름 제거 능력이 가장 우수했고, 두 군간의 유의한 차이는 없었다. Immunostaining후 공초점 레이저 주사현미경으로 남아있는 바이오필름을 관찰한 결과 3% H2O2 + 규조류 복합체 M에서 가장 적은 박테리아만 관찰되었다. 세정 전후 물성 변화 평가에서는 규조류 복합체 M은 시판 의치 세정제와 비교하여 세정 전 후 표면 거칠기, 미세경도, 색 그리고 굴곡강도의 차이가 통계적으로 유의하지 않았으며, 세포 독성 실험에서는 모든 군에서 relative cell count가 70% 이상으로 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 결론: 이산화망간을 도핑하여 만든 규조류 복합체는 과산화수소와 반응하여 연속적으로 미세 기포(O2)를 발생시키고, 이는 self-locomotion을 가능하게 하여 바이오필름의 세포 외 기질 (EPS)을 파괴하여 부착력을 감소시키는 것으로 사료된다. 이 기전에 의해 규조류 복합체는 의치상 레진에서 효과적으로 구강 바이오필름을 제거하며, 세정 전후의 물성 변화는 경미하고 세포 독성은 없는 것으로 판명되어 향후 치과 분야에서 활발한 적용이 기대된다.