Engineering of Baeyer-Villiger monooxygenase-based Escherichia coli biocatalysts for the production of 9-(nonanoyloxy)nonanoic acid from oleic acid

Abstract

Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) catalyze the conversion of ketone derivatives to esters by breaking a C-C bond and introducing an oxygen. BVMO from Pseudomonas putida (Pp-BVMO) plays a crucial role in the multi-step enzymatic conversion of oleic acid into 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid, which can be hydrolyzed into C9 chemicals for the production of bioplastics. However, the low activity of Pp-BVMO limited the bioconversion yield to 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid. Therefore, Pp-BVMO was engineered to improve the catalytic efficiency based on our previous studies. The AlphaFold-based structure modeling and in silico substrate access tunnel engineering was performed to accelerate substrate transport. This allowed to construct a highly active BVMO variant, which showed 1.8-fold greater catalytic efficiency (81s-1·mM-1). Furthermore, introduction of the BVMO quintuple mutant in the relatively chemical-tolerant Escherichia coli strains led to a significant improvement in the biotransformation performance. For instance, E. coli MG1655, expressing the quintuple mutant in addition to an oleate hydratase from Stenotrophomonas maltophilia and a secondary alcohol dehydrogenase from Micrococcus luteus, allowed to produce 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid from oleic acid to 27 mM at a cell density of 3 g dry cells/L. The productivity was approximately 2-fold higher than the previously reported. This study will contribute to the eco-friendly production of valuable fatty acid derivatives using biocatalysts.;Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs)는 C-C 결합을 끊고 산소를 도입함으로써 케톤 유도체를 에스터로 전환하는 생촉매입니다. Pseudomonas putida 유래의 BVMO (Pp-BVMO)는 oleic acid를 생분해성 플라스틱 소재의 단량체 생산에 이용될 수 있는 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid로 전환하는 다단계 효소반응에서 핵심 효소로서 중요한 역할을 합니다. 그러나 낮은 Pp-BVMO의 활성은 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid의 생산에 제한적인 영향을 줍니다. 따라서 우리는 이전 연구에서 구축된 Pp-BVMO 변이체를 중심으로 촉매 활성을 높이는 연구를 진행했습니다. 본 연구에서는 AlphaFold 기반의 구조 모델링과 인실리코 분석을 통해 터널 엔지니어링을 수행했으며 이를 통해 기존 변이체보다 180% 더 높은 촉매 활성 (81s-1·mM-1)을 나타내는 고활성 BVMO 변이체 (Pp-BVMO_ C302L/M340L/M380L/ S397A/L255A)를 구축했습니다. 또한, 내성이 높은 E. coli K-12 균주에 구축한 BVMO 변이체를 도입함으로써 생물전환 수율을 크게 향상시켰습니다. 예를 들어, 장쇄지방산 수송체, 올레산 수화효소 1, 알코올 탈수소효소와 BVMO를 동시 발현시킨 E. coli MG1655 생촉매는 oleic acid로부터 27 mM의 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid를 생산할 수 있었습니다 (건조균체량: 3 g dry cells/L). 생산 수율은 이전 보고된 생촉매보다 약 2배 높은 결과를 보였습니다. 이 연구는 생촉매를 이용한 고부가가치 소재들의 환경 친화적인 생산에 기여할 것입니다.