Effect of leucine-enriched cultivation conditions on the formation of volatile and non-volatile metabolites produced by Bacillus subtilis

Abstract

발효 과정 동안 발효식품의 감각적 특성과 관련된 휘발성 대사 산물은 미생물의 종류, 시간, 영양소, pH 수준 등의 배양 조건에 영향을 받는다. Leucine은 일부 휘발성 물질의 전구물질로써, 많은 식품의 맛과 향에 중요한 성분으로 작용한다. Bacillus subtilis가 생성하는 향미 성분에 대한 연구는 식품 상에서 많이 진행된 바 있으나, 식품은 매트릭스가 복잡하여 문제가 되는 성분에 대한 정확한 원인 규명이 힘들다는 단점이 있다. 본 연구는 leucine이 풍부한 합성 배지 시스템에서 질량분석학과 대사체학을 기반으로 B. subtilis KCTC1326의 발효 조건에 따라 생성되는 대사체 프로파일링의 변화를 조사하였다. 또한, 발효 조건에 상응하여 생성되는 특정 휘발성 및 비휘발성 대사체를 확인하였다. Leucine이 풍부한 배지에서 배양한 B. subtilis의 pH (BP)와 염 농도 (BS)에 따른 대사체의 변화를 연구하였다. Stir bar sorptive extraction (SBSE)로 휘발성 대사 산물을 추출하여 GC-MS로 분석하고 탄수화물, 아미노산, 유기산, 지방산 등의 비휘발성 대사 산물은 유도체화 후 GC-TOF/MS로 분석하였다. PLS-DA의 다변량 통계분석과 분산 분석을 적용하여 대사 산물과 발효 조건의 상관관계를 결정하였다. 전체적으로 overflow 대사과정은 대조구에 비해 BS와 BP 모두에서 활성화되었다. 일부 아미노산 (glutamine, serine, cysteine, proline)과 가지형 아미노산 유래 휘발성 물질 (3-methylbutanoic acid, ethyl 3-methylbutanoate, 3-methylbutyl acetate)의 생성은 배양 조건에 크게 영향을 받았다. 특히 leucine 대사과정에서, 강한 cheesy하고 rancid한 향 특성을 지닌 3-methylbutanoic acid가 BP에서 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 3-Methylbutanoic acid의 전구체인 3-methyl butanal은 BS에서 배양 시간이 증가할수록 급격하게 증가하였다. 3-methylbutanoic acid로부터 ethanol과 ester화 반응에 의해 생성되는 ethyl-3-methlybutanoate는 control group에서 가장 많이 생성되었다. Glutamic acid와 glutamine은 BP의 모든 배양시간 시료에서 다른 조건과 비교했을 때, 가장 높은 정량 값을 보였다. Lactic acid는 overflow 대사과정의 대표적인 대사산물로서 BP에서 가장 많이 생성된 것을 확인할 수 있었다. Proline은 osmoregulation에 의해 축적되는 것으로 알려져 있으며 BS 조건에서 가장 높은 정량 값을 보였다. 본 연구는 대사체학을 기반으로 Bacillus subtilis의 발효 조건이 leucine 유래의 특정 대사체의 생성과 밀접하게 관련 있다는 것을 확인하였다. ;Bacillus subtilis has been well-studied in terms of the changes in metabolome. B. subtilis is an important microorganism found in fermented soybeans. It is also involved in off-flavor production. However, regarding the formation of volatile metabolites attributed to different culture conditions, in particular, pH and slat concentration, little research has yet been implemented. In this study, the effects of culture conditions such as alkaline pH (BP) and high salt concentration (BS) on the metabolic responses of B. subtilis KCTC1326 which was isolated from fermented soybeans was investigated. In this study, B. subtilis was cultivated in a leucine-enriched medium and the samples were obtained according to cultivation times, such as exponential phase, early stationary phase and later stationary phase. Cultivation was conducted under different conditions, such as alkaline pH and high salt concentration. Then, volatile metabolites were extracted and analyzed using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined by stir bar sorptive extraction (SBSE). Also, non-volatile metabolites were analyzed by gas chromatography/ time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF/MS) after derivatization. Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) and analysis of variance (ANOVA) were applied to determine statistical differences in metabolites between samples. In overall, overflow metabolism was activated in both BS and BP compared to control (BC). Several metabolites, such as some amino acids and branched-chain amino acids-derived volatiles, were significantly varied according to culture conditions. Osmotic and pH stress elevate the formation of volatile metabolites derived from leucine, and pH level could be critical factor on the production of 3-methylbutanoic acid in B. subtilis. 3-Methyl butanal, a precursor of 3-methylbutanoic acid, increased rapidly along with cultivation time in BS. In leucine metabolism, the formation of 3-methylbutanoic acid, which has strong cheesy and rancid odor note, was highly increased in BP compared to other samples. This study provided how specific condition could affect the formation of metabolites in B. subtilis.