Sustained Delivery of Antifolates Using Polypeptide Thermogelling System for the Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

Abstract

In a recent our paper, folic acid pretreatments can significantly improve chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. In continuation of the research, we investigate clinically approved antifolates which have structural similarity with folic acid as a chondrogenic promoting compound in this research. We used tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSCs) as a stem cell resource and a poly(ethylene glycol)-poly(L-alanine) (PEG-PA) thermogelling system was used as a three dimensional cell culture matrix, where TMSCs and antifolates could simultaneously be incorporated during heat-induced in situ sol-to-gel transition. Initially, antifolates were prescreened based on cell proliferation and type II collagen (COL II) expression. Then, dapsone (1), pralatrexate (4), and trimethoprim (7) were selected as candidate compound, and detailed study in thermogelling matrix incorporating 0.1 μM antifolates were investigated on expression of various chondrogenic biomarkers including COL II, SRY box transcription factor 9 (SOX 9), and aggrecan (ACAN) at the mRNA and protein levels. Kartogenin (KGN) was used as a positive control molecule. The chondrogenic biomarkers were significantly increased in selected antifolates compared to control without increase in the osteogenic biomarker type I collagen (COL I) expression. In particular, pralatrexate was found to be the most excellent compound for chondrogenic differentiation of the TMSCs, even better than KGN. The nuclear translocation of the core-binding factor β subunit (CBFβ) and enhanced nuclear runt-related transcription factor 1 (RUNX1) by antifolates treatments suggested that the chondrogenic promoting mechanism is mediated by CBFβ and RUNX1 pathway. The polypeptide thermogel scaffold incorporating antifolates and mesenchymal stem cells can be very effective in promoting chondrogenic differentiation of stem cells and might be used for injectable tissue engineering for cartilage repair.;본 연구에서는 엽산과 구조적 유사성을 가지며 임상적으로 승인 된 antifolate의 연골 분화 촉진 능력에 대해 탐구하였다. 편도-유래 중간엽 줄기세포 (TMSCs)는 3차원의 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(L-알라닌) 써모겔 시스템에서 배양되었으며, antifolate는 열에 의한 in situ sol-to-gel 전환에 의해 시스템에 도입되었다. 먼저, 7개의 antifolate에 대해 세포 생존력 및 연골 분화 바이오 마커 COL II의 mRNA 발현을 기준으로 사전 선별을 진행했다. 그리고 우수한 결과를 나타낸 dapsone, pralatrexate, trimethoprim을 선정하여 세부적인 분화 연구를 진행했다. 분화된 줄기세포의 바이오 마커 발현은 mRNA와 단백질 수준에서 연구되었다. 실험군에서 연골 형성 바이오 마커인 COL II, SOX 9 그리고 ACAN의 발현은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 증가를 나타냈다. 또한, 그 과정에서 골 형성 바이오 마커인 COL I은 거의 발현되지 않았다. 특히, pralatrexate는 KGN보다 훨씬 높은 결과를 나타내며 TMSCs의 연골 분화에 가장 우수한 화합물로 밝혀졌다. Antifolate 처리에 의한 CBFβ의 핵 전좌 및 RUNX1의 핵 발현 증가는 웨스턴 블롯과 면역 형광법에 의해 확인되었으며, 이는 antifolate의 연골 분화 메커니즘이 CBFβ 및 RUNX1에 의해 매개됨을 시사한다. 이 연구는 antifolate와 중간엽 줄기세포를 포함하는 3차원 폴리펩타이드 써모겔 시스템이 줄기세포의 연골 분화를 촉진하는 데 매우 효과적이며, 유망한 주사형 조직 공학 시스템임을 시사한다.