Comparative analysis of volatile and non-volatile metabolites produced by Saccharomycopsis fibuligera according to cultivation temperature

Abstract

Saccharomycopsis fibuligera KJJ81 and Saccharomycopsis fibuligera KPH12 are highly saccharolytic and proteolytic yeasts obtained from Nuruk, a mixed starter culture used to make Korean traditional alcoholic fermented drink, Makgeolli. Makgeolli is usually fermented at 25±3℃, but little is known on the metabolites produced by S. fibuligera at low temperature (25℃). Therefore, the profiles of volatile and non-volatile metabolites formed by S. fibuligera KPH12, S. fibuligera KJJ81 and Saccharomyces cerevisiae S288C (a reference strain) were compared in this study. All strains of yeast were cultivated in yeast peptone dextrose (YPD) broth at 25℃ and 37℃, for different cultivation times (6, 10, 16 and 22 hours). Volatile metabolites were extracted by stir bar sorptive extraction (SBSE) method and then analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Non-volatile metabolites went through the process of modified fast filtration method and derivatized, followed by gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF/MS) analysis. When the results of partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and analysis of variance (ANOVA) were compared, the profiles of volatile and non-volatile metabolites in all strains showed significant differences depending on strains and temperatures. When all three yeast strains were cultivated at 25℃, for reference strain S288C group, major volatile metabolites were terpenes and alcohols. Terpenes like farnesol, geraniol and nerolidol, and alcohols like dodecan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethanol were detected as major volatiles. On the other hand, in KPH12 group, major volatiles formed were mostly fusel alcohols, such as butan-1-ol and furan-2-ylmethanol. Also, 2H-furan-5-one and 3-phenylfuran were major volatile metabolites produced. In KJJ81 group, major volatile metabolites formed at 25℃ were mainly esters and lactones. Esters such as butyl cinnamate, ethyl hexanoate, ethyl cinnamate, ethyl octanoate, farnesyl acetate and butyl acetate were major volatiles. Especially, lactones including δ-decalactone, γ-decalactone, δ-tridecalactone and δ-dodecalactone were major volatiles. Among three yeast stains, KJJ81 was the producer of most diverse kinds of esters and lactones. This tendency also continued, when fermented at 37℃. Thus, this study has proved that cultivation temperature greatly affected the volatile and non-volatile metabolite profiles of S. fibuligera (KPH12 and KJJ81) and S. cerevisiae S288C. Also, Saccharomycopsis fibuligera KJJ81 has the ability to produce more esters and lactones at both 25℃ and 37℃, compared to Saccharomycopsis fibuligera KPH12 and Saccharomyces cerevisiae S288C.;본 연구에서는 누룩에 존재하는 효모 중 높은 당 분해 및 단백질 분해 기능을 가진 Saccharomycopsis fibuligera KJJ81과 Saccharomycopsis fibuligera KPH12를 대사체학적으로 비교분석하기 위해 참조 균주 Saccharomyces cerevisiae S288C와 함께 분석을 수행하였다. 일반적으로, 한국 전통 발효주류인 막걸리의 상업적 발효는 일반적으로 25±3℃에서 이루어지지만, 30℃ 미만의 온도에서 배양한S. fibulige의 대사체 연구는 부족한 실정이다. 따라서, 배양 온도 (25℃와 37℃)와 배양시간 (0시간, 6시간, 16시간, 22시간)에 따라 생성된 Saccharomycopsis fibuligera 두 균주의 휘발성 대사체와 비휘발성 대사체를 참조 균주와 비교 분석하였다. 세 균주는 모두 YPD 액체배지에서 배양하였다. 휘발성 대사체 분석을 위해 stir bar sorptive extraction (SBSE) 방법을 사용하였고 GC-MS를 이용해 분석하였다. 비휘발성 대사체는 추출한 뒤 유도체화 하여 GC-TOF/MS로 분석하였다. 조건별 휘발성 및 비휘발성 대사체 차이를 확인하기 위해 principal component analysis (PCA), partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) 통계분석을 하였다. 25℃에서 배양 시, 참조 균주인 S288C 그룹에서는 dodecan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethanol와 같은 고급알코올류가 주요 휘발성 대사체로 선정되었다. KPH12 그룹의 경우, 고급알코올류인 butan-1-ol 와 furan-2-ylmethanol 뿐만 아니라, 2H-furan-5-one, 3-phenylfuran 그리고 phenol이 주요 생성 휘발성 대사체로 선정되었다. KJJ81 그룹에서는 주요 휘발성 대사체가 크게 고급 알코올, 에스터 그리고 락톤류로 나뉘어졌다. 특히, 주요 대사체 중2-methylpropan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol 그리고 2-phenylethanol과 같은 고급 알코올류는 leucine 또는 phenylalanine에서 유래된 성분들이다. 에스터류 중, butyl cinnamate, ethyl hexanoate, ethyl cinnamate, ethyl octanoate, farnesyl acetate그리고butyl acetate가 주요 생성 대사 물질이었다. 락톤류는 oleic acid와 linoleic acid에서 유래된 δ-decalactone, γ-decalactone, δ-tridecalactone 그리고 δ-dodecalactone이 주로 생성되었다. 총 세 효모 균주 중, KJJ81이 가장 다양한 종류의 에스터와 락톤 성분들을 생성하였다. 이러한 경향은 37℃에서도 동일했다. 따라서, 해당 연구는 Saccharomycopsis fibuligera KJJ81이 Saccharomycopsis fibuligera KPH12 및 Saccharomyces cerevisiae S288C에 비해, 25℃와 37℃에서 모두 다량의 주요 향미성분을 생성하는 능력이 있음을 입증한 연구라는 의의를 갖는다.