The Effectiveness of Super-Repressor IκB-loaded Exosomes in Chronic Post-Ischemia Pain Models

Abstract

Complex regional pain syndrome (CRPS), a painful and disabling complication after an injury, often causes significant impairment of daily activities and functions. CRPS can be classified into two subtypes, based on the presence (type II) or absence (type I) of direct nerve injuries. Most CRPS patients are considered to suffer from type I. Nuclear factor kappa B (NFκB) is believed to be a key factor in CRPS via several underlying pathological mechanisms. Affected limbs of CRPS patients show signs of chronic ischemia, which can induce NFκB activation by the formation of reactive oxygen species and peroxynitrite. The biological fluids in blisters and spinal cord fluid contain high levels of inflammatory mediators, including tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 (IL-1), and IL-6, which can be activated or induced by NFκB. Moreover, neuropeptides such as substance P and calcitonin gene-related protein, which are aberrantly expressed during CRPS, interact with NFκB. The chronic post-ischemia pain (CPIP) model has been proposed as an animal model for type I CRPS. Under general anesthesia, a tight tourniquet is applied around the paw of the animal for 3 h and then released for reperfusion. Mechanical and cold allodynia occur chronically in the ipsilateral paw and more sporadically in the contralateral paw and persist for at least 4 weeks after ischemia-reperfusion (I/R) injury. The CPIP model demonstrates several CRPS-like features, including edema, hyperemia, and the development of mechanical and cold allodynia, without direct nerve damage. Exosomes have been recognized as potent therapeutics or drug delivery vehicles for transferring various materials, including proteins and regulatory genes, to target cells. The nonimmunogenic nature of these nanovesicles enables them to protect their cargo from serum proteases and immune responses. Recently, super-repressor inhibitory kappa B (srIκB)-loaded exosomes (Exo-srIkB) were shown to be potential anti-inflammatory options in various inflammatory disease models. In the present study, the therapeutic effect of Exo-srIκB was investigated on a rodent model with CPIP. These experiments used C57BL/6 mice (male, 20–25 g). First, in the process of making the CPIP model, the paw withdrawal test (PWT) and rotarod test were performed for 48 h. Thirty minutes after the CPIP model was made, the PWT and rotarod test were performed again for four groups administered intraperitoneally with 1×109 particle number (pn) per 0.1 mL vehicle, 1×109 pn per 0.1 mL Exo-srIkB, 1×1010 pn per 0.1 mL Exo-srIkB (10 times higher concentration), and 0.1 mL of 30 mg/kg pregabalin (positive control) (8 mice per each group). After drug injection, the PWT and rotarod test were performed for 48 h again. The sham model applied a pre-cut O-ring to the left paw in the same conditions as the CPIP model. Paw tissues affected from the sham and CPIP models were collected (8 mice per each group). For the four groups, tissues of affected paws were obtained after 24 and 48 h of intraperitoneal injection for western blot (6 mice representing each group). Cytokine and chemokine arrays were also conducted on sham, vehicle, Exo-srIkB, and pregabalin groups (6 mice representing each group). PWTs of both hind limbs of CPIP mice were significantly reduced compared to sham mice, and the relative densities of phospho-inhibitory kappa B (p-IκB) and inhibitory kappa B (IκB) were significantly altered in the CPIP mice compared to those in the sham group. Administration of Exo-srIκB increased the PWTs of the affected hind limbs compared to the vehicle and pregabalin groups, and the relative densities of p-IκB and IκB showed a significant change compared to the vehicle group 24 h after drug injection. In this study, almost all cytokines and chemokines were identified in the paw tissues of mice. In the CPIP model, characteristic cytokines and chemokines related to inflammation were observed after reperfusion in the paw tissues. The cytokines, which showed a distinct difference between the vehicle group and the Exo-srIκB group, included myeloperoxidase, osteopontin, pentraxin 3, serpin E1/PAI-1, and endoglin/CD105 and the chemokines included C10, complement component C5/C5a, monocyte chemoattractant protein-2, macrophage inflammatory protein-1γ, IL-16, MCP-5, and stromal cell-derived factor 1. In conclusion, intraperitoneal administration of Exo-srIκB can reduce mechanical allodynia through NFκB inhibition. Moreover, several cytokines and chemokines were found to be involved in the pathogenesis of CRPS in mice with CPIP. These results particularly highlight the involvement of NFκB in the pathogenesis of CRPS and provide a theoretical background for new therapeutic approaches for CRPS.;복합부위통증증후군은 골절, 염좌 등의 손상에 의해 발생하는 일상 생활 및기능에 심각한 장애를 야기하는 질환이다. 복합부위통증증후군 환자는 2가지의 아형으로 분류되는데 직접적 신경 손상이 있는 2형, 직접적 신경 손상이 없는 1형으로 나뉘어지며 대부분의 복합부위통증증후군 환자들은 1형으로 보고된다. Nuclear factor kappa B (NFkB)는 복합부위통증증후군의 여러 발병 기전에 있어 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 복합부위통증증후군 환자의 해당 통증 부위는 만성 허혈의 징후를 보이고 이는 활성산소종 및 peroxynitrite를 형성하여 NFkB 활성화를 유도할 수 있다. 또한 염증 매개체인 TNFα, IL-1β, IL-6는 복합부위통증증후군 환자의 수포 및 척수액에서 발견될 수 있는데 이들 모두 NFkB를 활성화할 수 있고 NFkB로부터 활성화될 수도 있다. 게다가 NFkB는 복합부위통증증후군에서 비정상적으로 발현되는 CGRP와 substance P와 같은 신경펩타이드와 상호작용한다. 만성 허혈 후 통증모델은 1형 복합부위통증증후군의 동물모델로 제안되었다. 만성 허혈 후 통증모델은 전신마취하 생쥐의 다리에 꽉 맞는 지혈대를 3시간동안 거치하였다가 재관류 시키게 된다. 만성적 동측 다리 기계적 이질통 및 냉각 이질통, 보다 산발적인 반대측의 기계적 이질통 및 냉각 이질통이 적어도 허혈/재관류 손상 후 4주간 지속되는 것이 증명되었다. 만성 허혈 후 통증모델은 직접적 신경 손상 없이도 부종, 발적, 기계적 이질통, 냉각 이질통 등 복합부위통증증후군과 비슷한 여러 증상들을 보인다. 엑소좀은 단백질이나 발현조절 유전자 등의 여러 물질을 표적 세포에 전달하므로 약물 전달 운반체 또는 잠재적 치료제로 인식되어지고 있다. 이러한 나노 소포의 비면역적 특성은 단백질 가수분해 효소 및 면역반응으로부터 운반물을 지킬 수 있게 한다. 최근 super-repressor ihibitor κappa B (srlκB)를 탑재한 엑소좀인 super-repressor IkB-loaded exosome (Exo-srIkB)은 여러 염증 질환 모델에 대한 유망한 항염증제로 보고되고 있다. 본 연구에서는 만성 허혈 후 통증모델에 대한 이러한 Exo-srIkB의 효과에 대하여 조사하였다. 실험에는 수컷 C57BL/6 생쥐 (20-25g)가 사용되었다. 먼저 만성 허혈 후 통증모델을 만드는 과정에서 48시간 동안 기계적 역치측정 및 로타로드 행동실험이 수행되었다. 만성 허혈 후 통증 모델이 만들어지고 30분 후 복강 내 0.1ml씩 vehicle (음성 대조군), 1x109 Exo-srIkB, 1x1010 Exo-srIkB (고농도), 30mg/kg Pregabalin (양성 대조군)을 주입하고 8마리씩 4군으로 구분하였다. Sham 군에 대해선 미리 잘라 놓은 O-ring을 왼쪽 발에 적용하고 만성 허혈 후 통증모델과 같은 조건을 주었다. 약물 주입 후 48시간동안의 다시 역치 변화를 확인하고 로타로드 행동실험 결과를 확인하였다. 또한 4군에 대해 약물 주입 24시간 후 및 48시간 후에서의 왼쪽 뒷발 조직을 얻어 웨스턴블롯을 시행하였다. Sham, vehicle, Exo-srIkB, pregabalin 그룹의 동측 발 조직에 대하여 약물 주입 24시간 후 사이토카인어레이, 케모카인어레이를 시행하였다. 본 연구에서는 만성 허혈 후 통증모델 생쥐의 양측 뒷발의 기계적 역치 모두 sham 군에 비해 현저히 감소하였으며, 만성 허혈 후 통증모델의 왼쪽 뒷발 조직에서 phospho-inhibitory kappa B (p-IkB) 및 inhibitory kappa B (IkB)의 수치가 sham 군과 비교해 현저히 변화하는 것을 보여주었다. Exo-srIkB을 주입한 생쥐군에서는 vehicle 군과 pregabalin 군에 비해 발움추림역치가 증가하였고, 약물주입 24시간 후 왼쪽 발 조직에서 p-IkB 및 IkB 수치가 vehicle 그룹과 유의한 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 생쥐의 왼쪽 뒷발 조직에 대해 거의 대부분의 사이토카인과 케모카인을 확인하였다. 만성 허혈 후 통증모델에서는 염증반응과 관련이 있는 특징적 사이토카인과 케모카인들이 뒷발 조직에서 발겼되었다. Vehicle 그룹과 Exo-srIkB 그룹에서 현저한 차이를 보인 사이토카인은 myeloperoxidase, osteopontin, pentraxin 3, serpin E1/PAI-1, endoglin/CD105 이었고, 케모카인어레이에서는 C10, complement component C5/C5a, monocyte chemoattractant protein-2, macrophage inflammatory protein-1γ, IL-16, MCP-5, and stromal cell-derived factor 1 등의 케모카인이 차이를 보여주었다. 결론적으로 Exo-srIkB를 복강내에 주입한 결과 NFkB를 저해함으로써 만성 허혈 후 통증모델의 기계적 역치를 회복시켰다. 또한 만성 허혈 후 통증모델 생쥐에서 복합부위통증증후군의 발병과 연관되었다고 추정할 수 있는 여러 사이토카인과 케모카인을 발견할 수 있었다. 본 연구는 CRPS의 발병기전에서 NFkB가 중요한 역할을 하고 있음을 보여주고 있다. 따라서 본 연구의 결과가 앞으로 CRPS의 새로운 치료제에 대한 이론적인 배경을 제공하는 계기가 되었으면 한다.