3T3-L1 3차원 배양을 이용한 폴리페놀에 의한 지방 분화 억제력 및 커큐민 세포 흡수율 평가

Abstract

만성 대사질환을 야기하는 비만은 과잉섭취, 신체 활동량 감소, 유전 등 여러 복합 요인에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 체내 잉여 에너지가 중성지방 형태로 다량 축적되어 비만을 초래한다. 최근 전 세계적으로 비만 유병률과 그로 인한 사회경제적 손실이 급증함에 따라, 비만 관리에 대한 개인과 국가 차원의 공중보건학적 책임이 강조되고 있다. 비만을 예방하기 위한 물질 중 하나로 식품에 함유된 폴리페놀 화합물이 주목을 받아왔다. 하지만, 대부분의 연구가 2차원 세포배양모델이나 동물모델을 활용하고 있어, 인체 내 생리학적 거동을 반영하지 못하거나 윤리적 문제 및 인간과의 불합치로 인해 사람의 상태를 완전히 반영하는 데에 어려움이 있다. 이에 본 연구에서는 생체 대응성이 높은 3차원 세포배양모델에서 폴리페놀 화합물의 지방세포 분화 억제능력과 세포 흡수율을 확인하고자 하였으며, 3차원 모델이 in vivo를 모사하는 보조적 연구 방법으로서 활용 가능한지를 함께 평가하고자 하였다. 폴리페놀 화합물들은 선행 연구를 바탕으로 3T3-L1 일반 배양에서 지방분화 억제 정도가 다르게 나타난 커큐민(curcumin), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin galate; EGCG), 퀘르세틴(quercetin), 레스베라트롤(resveratrol) 4가지로 선정하였다. 이들이 지방세포의 분화와 지방 축적을 얼마나 억제하는지 화합물별로 비교하고자 스페로이드의 크기 감소율과 중성지방(triglyceride) 양을 측정하였으며, 지방세포가 분화하면서 배양액에 분비되는 렙틴(leptin)의 양을 ELISA로 측정하였다. 또한, 일반배양법에서의 선행 결과와 본 연구를 통해 커큐민이 지방분화 및 지방 축적 억제 효능이 가장 높았음을 고려하여, 3T3-L1 스페로이드 세포 내에 커큐민이 흡수되는 양상과 흡수된 정도를 파악하고자 하였다. 커큐민을 농도 및 시간별로 처리한 후 세포를 용해하여 HPLC로 분석하였고, 배양액에서의 커큐민 농도도 분석하여 변화된 정도를 함께 확인하여 수용액 상태에서 커큐민의 안전성을 함께 관찰하였다. 그리고 커큐민과 퀘르세틴을 저용량으로 한 번 또는 반복 처리하였을 때 보이는 중성지방 축적 억제 능력을 평가하여 사람이 식품으로 폴리페놀 화합물을 섭취하는 상황에서의 지방 분화 억제 효과를 모사하고자 하였다. 실험 결과, 커큐민, 퀘르세틴 그리고 레스베라트롤 3개의 화합물은 20 µM 처리에서 유의적인 지방분화 및 중성지방 축적 억제율을 보여주었다. 반면에 에피갈로카테킨 갈레이트는 유의적인 차이를 보이지 않아 분화 억제 능력이 없거나 미미한 것으로 나타났다. 커큐민을 스페로이드에 처리하여 HPLC로 세포 내 흡수율을 측정한 결과, 2시간에서 최대의 흡수율을 보여주었으며 시간이 지남에 따라 흡수량이 점차 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 지방전구세포 스페로이드를 지방세포로 분화시키며 커큐민과 퀘르세틴을 반복적으로 처리한 결과, 5 µM의 커큐민을 반복 처리하였을 때 10 µM 한 번 처리와 유사한 정도로 대조군 대비 유의적인 분화 억제 능력을 나타냈다. 결과적으로 실험에 사용된 폴리페놀 화합물 중 커큐민, 퀘르세틴, 레스베라트롤은 20 µM에서 지방분화 및 중성지방 축적의 억제에 유의적인 효과를 보여주어 스페로이드 모델에서 항 비만효과를 보여주었다. 커큐민의 세포 흡수율 평가에서 커큐민은 처리 후 2시간이 되는 때 세포 내에서 최대 농도에 이르렀지만, 오래 머무르지 못하고 감소하여 세포 내 흡수 효율이 낮음을 알 수 있었다. 또한 흡수되는 양도 처리 양에 비해 극소량인 것으로 나타났다. 하지만 커큐민을 생체 내 최대한으로 도달할 수 있는 농도에 가까운 10 µM로 반복 처리 했을 때 동일 농도의 한 번 처리에 비해 유의적인 중성지방 축적 억제 효과를 나타냈고, 5 µM의 반복적인 처리가 10 µM의 한 번 처리와 유사한 수준으로 대조군 대비 유의한 억제 수준을 나타내어, 식품에 함유된 커큐민을 꾸준히 섭취하였을 때 중성지방의 축적을 억제하는 데에 효과가 있을 수 있음을 알 수 있었다. 이를 통해 3차원 세포배양모델에서 커큐민, 퀘르세틴, 레스베라트롤 20 µM의 처리가 지방분화 억제 효과가 있음을 알 수 있었으며, 커큐민이 세포 내로 흡수되는 정도는 매우 낮으나 이를 식품으로 꾸준히 섭취하는 상황에서는 중성지방의 축적을 억제할 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 2차원 세포배양모델에서 선행되었던 결과와 비교하였을 때, 두 모델 모두에서 네 화합물 처리에 의한 분화의 억제 방향과 커큐민의 세포 내 흡수 경향은 유사하지만, 억제 수준과 흡수된 정도가 3차원 세포배양모델이 2차원 세포배양모델에 비해 수치적으로 낮은 것을 알 수 있었다. 이러한 경향성을 나타낸 배경으로는 세포 배양모델에 따라 1) 세포가 화합물에 노출되는 정도에 차이가 있고, 2) 화합물에 대한 감수성 및 세포 사멸에 대한 저항성 차이를 나타낼 수 있으며, 3) 화합물이 가진 세포 내 흡수 능력이 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 이에 생체 대응성을 높인 3차원 배양모델을 활용할 경우, 기초연구와 동물/임상연구간의 가교 역할을 하는 중개연구 모델로 활용이 가능할 것이라 기대할 수 있었다. 또한 모델 간 격차를 해소함으로써 후보물질이나 농도 설정에 대한 예측력을 높이는 데 기여할 수 있을 것이라고 기대된다.;Obesity, which causes chronic metabolic diseases, is known to be caused by several complex factors such as excessive intake, decreased physical activity. Excess nutrients accumulate mostly in the form of triglycerides, leading to obesity. In recent years, the prevalence of obesity and its social-economic losses are rapidly increasing worldwide, which leads to public health responsibility at the individual and national level for obesity management is being emphasized. Polyphenol compounds contained in food have been attracting attention for its anti-obesity effect. Most adipocyte related two-dimensional cell culture models or animal models. In this case, it is difficult to fully reflect the human condition due to either not reflecting the physiological behavior in the human body or due to ethical issues and inconsistency with humans. Therefore, in this study, a three-dimensional cell culture model with increased bioreactivity was used as an research method to simulate in vivo. The purpose of this study was to confirm the inhibition ability of adipocyte differentiation by polyphenol compounds and cell uptake rate of curcumin in a three-dimensional cell culture model. To compare how much polyphenol compounds(curcumin, epigallocatechin gallate, quercetin, resveratrol) inhibit adipocyte differentiation and fat accumulation by compound, the size reduction rate of spheroids and triglycerides were measured and their correlation was confirmed. When low doses of curcumin and quercetin were treated once and repeatedly. Thereafter, the amount of leptin secreted into the culture medium as adipocytes differentiated was measured by ELISA. In addition, considering that curcumin had the highest efficacy in inhibiting fat differentiation and triglyceride accumulation through the previous results in both of the general culture method and this study, the absorption pattern and degree of curcumin in 3T3-L1 spheroid cells were measured. After treatment with curcumin by concentration and time, cells were lysed and analyzed by HPLC. Curcumin concentration in medium was also analyzed to confirm the degree of change. As a result of the experiment, the three compounds curcumin, quercetin and resveratrol showed significant inhibition of fat differentiation and triglyceride accumulation at 20 µM treatment. On the other hand, epigallocatechin gallate did not show a significant difference, indicating that there was no or insignificant differentiation inhibitory ability. Curcumin, which showed the best effect on inhibition of differentiation, underwent HPLC analysis, which showed the best uptake of cells at 2 hours. It was also observed that the amount of absorption gradually decreased over time. As a result of repeatedly treating curcumin and quercetin while differentiating preadipocyte spheroids into adipocytes, repeated treatment with 5 µM curcumin showed a significant inhibitory ability of differentiation 10 µM treatment once. As a result, in this study, curcumin, quercetin, and resveratrol among the polyphenol compounds used in the experiment showed significant effects on the inhibition of fat differentiation and triglyceride accumulation at 20 µM, showing anti-obesity effects in the spheroid model. Therefore, It can be suggested that curcumin contained in food may be effective in suppressing the accumulation of triglycerides when continuously ingested. In addition, in the case of curcumin, repeated treatment of 10 µM, which is close to the maximum concentration that can be reached in vivo, had a significant inhibitory effect on triglyceride accumulation compared to single treatment at the same concentration. and Repeated treatment of 5 µM compared to control showed significant inhibition level similar to that of a single treatment of 10 µM. In addition, in the evaluation of the cell uptake rate of curcumin, curcumin showed the maximum uptake rate in the cell at 2 hours after treatment, but residue concentration of cell calculated was very small compared to treated concentration. When these results were compared with the previous results in general culture, the three-dimensional model showed a lower degree of inhibition of differentiation by the treatment of the four compounds. Both models showed the maximum intracellular uptake time was at 2 hours. and the amount of uptake was very small compared to the amount of treatment. However, the degree of absorption of curcumin into the cell was lower in the three dimentional model than in general culture. Observed difference can be interpreted by three points of basis. 1) Differences in connectivity between cells, culture medium, and compounds, 2) Differences in sensitivity to compounds and resistance to apoptosis, and 3) Differences in intracellular absorption capacity of compounds may have had an effect. Based on this, the study tried to evaluate whether the three-dimensional culture model can be utilized as a new auxiliary research method that can improve the bio-responsiveness compared to general culture and narrow the gap between the two models by simulating in vivo.