P-cresyl sulfate Promotes Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Dysfunction, Leading to the Development of Neointimal Hyperplasia

Abstract

배경: 투석혈관통로의 기능부전은 혈액투석을 받는 환자의 입원 및 이환의 주요 원인이며 주로 혈관평활근세포의 증식으로 인한 신생내막증식에 의한 혈관내 협착이 주요 병태생리이다. 최근 연구에서는 p-크레실 황산염(p-CS)가 혈액투석 환자의 투석혈관통로의 예후와 관련이 있다고 보고하였다. 그러나 p-CS에 의해 유도된 혈관 독성의 메커니즘은 잘 알려지지 않았다. 이 연구의 목적은 p-CS가 혈관평활근세포의 증식에 관여하고 혈관내피세포에의 산화스트레스 및 염증 반응을 유도하여 신생내막증식의 발생에 기여하는지에 대한 연구이다. 방법: 대동맥유래평활근세포를 p-CS(10-1000 μmol/L)로 처리하고 BrdU 세포 증식 분석으로 증식 정도를 측정하였고 ERK1/2 및 p38 MAPK에 대해 Western blotting을 통해 인산화 단백질 발현 정도를 분석하였다. 제대정맥혈관내피세포에 1000 μmol/L의 p-CS를 처리하고 활성산소종을 측정하였다. 혈관내피세포에서 p-CS를 처리하여 ICAM-1, MCP-1, eNOS, iNOS의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 분석하였으며, NF-κB, ICAM-1, MCP-1의 단백질 발현 정도를 Western blotting, ELISA assay를 이용하여 분석하였다. p-CS에 의해 자극된 혈관내피세포가 혈관평활근세포 증식에 영향을 미치는지 확인하기 위해 Transwell 모델을 이용한 혈관평활근세포와 혈관내피세포의 공동배양을 수행하였다. 또한 p-CS에 의해 자극된 혈관내피세포에 N-acetyl-L-cysteine과 probenecid 및 항 MCP-1 항체와 항 ICAM-1 항체를 처리하여 혈관내피세포 증식의 억제 효과를 조사하였다. p-CS로 자극한 쥐의 대동맥 Ex vivo 모델을 이용하여 신생내막증식을 관찰하였다. 결과: p-CS는 용량 의존적으로 혈관평활근세포의 증식을 자극하고 ERK1/2 및 p38 MAPK의 인산화를 촉진하였다. 혈관내피세포에서 p-CS는 활성산소종을 용량 의존적으로 증가시켰다. ICAM-1, MCP-1 및 iNOS의 mRNA를 상향 조절하였으며, eNOS의 mRNA는 하향 조절하였다. 또한 p-CS는 혈관내피세포에서 NF-κB, ICAM-1 및 MCP-1의 단백질 발현을 증가시켰으며, N-acetyl-L-cysteine과 probenecid를 첨가하였을 때 ICAM-1과 MCP-1의 단백질 발현을 감소시켰다. 공동배양 모델에서 p-CS로 자극된 혈관내피세포의 영향에 의해 혈관평활근세포의 증식이 촉진되었고, 혈관내피세포에 N-acetyl-L-cysteine과 probenecid 및 항 ICAM-1 항체와 항 MCP-1 항체를 첨가하였을 때 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 쥐의 대동맥 Ex vivo 모델에서 p-CS 처리 배양 7일째 신생내막증식을 확인하였다. 결론: 본 연구에서 p-CS는 혈관평활근세포의 증식을 직접적으로 촉진하고, 혈관내피세포 기능부전을 유발하여 간접적으로도 혈관평활근세포의 증식에 영향을 주며, 혈관의 신생내막증식을 유발함을 확인하였다. 이는 p-CS가 혈액투석 환자에서 투석혈관통로 기능부전에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.;Background: Vascular access failure is a leading cause of hospitalization and morbidity in hemodialysis patients; it predominantly results from vascular smooth muscle cell (SMC) proliferation-related neointimal hyperplasia. P-cresyl sulfate (p-CS) is associated with the outcome of vascular access in hemodialysis patients. However, the mechanism of p-CS-induced vascular toxicity remains poorly understood. The purpose of this study was to determine whether p-CS promotes SMC proliferation and endothelial dysfunction; it also examined the contributions of these processes to the formation of neointimal hyperplasia. Methods: Human aortic SMCs were treated with p-CS and their proliferation was assessed and extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways were evaluated. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with p-CS and their reactive oxygen species levels were measured. The levels of mRNA expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and protein expression of nuclear factor kappa B (NF-κB), ICAM-1, MCP-1were evaluated in HUVECs. The mRNA expression levels of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) were also evaluated. Co-cultures of SMCs and HUVECs using the Transwell system were conducted to determine whether the endothelial response to p-CS promotes SMC proliferation. An ex vivo model of the mouse aorta was used to confirm the development of neointimal hyperplasia after p-CS stimulation. Moreover, to investigate the p-CS induced oxidative stress, antioxidant including N-acetyl-L-cysteine (NAC) and probenecid were treated with p-CS stimulated SMCs, HUVECs and harvested mouse aorta. Results: p-CS induced SMC proliferation in a dose-dependent manner, while promoting the phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK. In HUVECs, p-CS upregulated the mRNA levels of NF-κB, ICAM-1, and MCP-1, increasing in protein expression. p-CS increased the mRNA expression level of iNOS, but decreased the mRNA expression level of eNOS. Increased SMC proliferation was observed in the p-CS-treated co-culture model of HUVECs and SMCs. NAC and probenecid significantly inhibited the p-CS induced endothelial injury and the subsequent SMCs proliferation. In ex vivo, mouse aorta cultured with p-CS revealed the formation of neointimal hyperplasia. Conclusion: Our findings indicate that p-CS induces SMC proliferation directly or indirectly by promoting endothelial dysfunction, resulting in the formation of neointimal hyperplasia. Further studies are needed to determine the clinical relevance of p-CS in vascular access dysfunction.