Engineering of Escherichia coli-based biocatalysts for the production of glycolic acid and ethylene glycol from formaldehyde

Abstract

글리콜산과 에틸렌글리콜은 섬유, 화장품, 포장, 제약 등 산업에서 다양한 응용이 가능한 탄소 2개로 이루어진 고부가가치 화합물이다. 이를 생산하기 위해 화석 자원을 이용한 화학 공정은 환경오염을 유발하기 때문에 친환경 미생물 생체 촉매 시스템을 이용한 재생가능한 바이오매스 (예: 자일로스, 포도당, 에탄올)로부터 고부가 소재 생산에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 언급된 바이오 매스는 대사 경로의 주요 탄소 공급원이므로 미생물 세포 공장을 이용할 경우 기질 소모가 있어서 고수율로 타겟 프로덕트를 생산할 수 없다. 따라서, 본 연구에서는 탄소 1개로 이루어진 공급 원료로 큰 관심을 받고 있는 포름알데히드를 기질로 사용하여 미생물 세포 공장에서 기질 손실을 최소화하고자 하였다. 선행 연구에서는 포름알데히드에서 다양한 고부가 소재의 전구체를 생산하는 대장균 K-12 유래 글리옥실레이트 카보라이게이즈(EcGCL)의 효소 촉매 부위와 기질의 입구 부분을 기질-효소 결합체의 구조 분석과 효소 자체의 구조를 분석하여 엔지니어링을 진행했다. 이를 통해 네 개의 잔기가 교체된 EcGCL R484MN283QL478MM488L 효소 개량체를 구축하였고, 9.2 M-1·s-1의 촉매효율을 향상시켰고, wild-type 보다 약 6배 개선된 결과를 얻었다. 하지만 세포 내 활성을 비교하였을 때 4개의 잔기가 교체된 개량체 보다 EcGCLR484MN283QL478M의 글리콜알데히드 전환율이 높았다. 따라서, EcGCLR484MN283QL478M를 기반으로 한 에틸렌글리콜, 글리콜산 전세포 생촉매 시스템을 구축하고자 했다. 본 연구에서는, 우리는 포름알데히드로부터 글리콜산과 에틸렌 글리콜에 대한 전세포 생물 촉매 캐스케이드 반응을 위한 시스템을 구축했다. 전체 세포 생체 촉매 시스템은 대장균의 새로운 생체 변환 경로 설계, 캐스케이드 반응에 적합한 효소 선택, 대장균 내 효소들의 균형 있는 발현, 대사 공학 및 생체 공정 공학을 포함하여 연구를 진행했다. 먼저, 포름알데히드로부터 글리콜산과 에틸렌글리콜의 합성을 위한 EcGCL 기반의 새로운 전세포 생체 촉매 시스템이 설계되었다. 또한, 중간체(글리콜알데하이드)는 효소 대장균 유래 락트알데히드 탈수소효소 및 대장균 유래 락트알데히드 환원효소를 선택하여 글리콜산과 에틸렌글리콜로 빠르게 전환하였고 이를 통해 알데하이드 독성 완화 및 수율을 증가시켰다. 또한, BioCyc 및 KEGG 게놈/경로 데이터베이스를 통한 부반응과 관련된 대사 경로가 조사되었다. 포름알데히드 및 글리콜산 분해 경로를 통한 부반응 최소화를 위해 두개의 플라스미드 유도성 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 frmA, glcD 결손 균주를 개발하였다. 또한 반응액에 포름알데히드를 간헐적으로 공급하는 생물공정을 구축하고 pH-stat glucose feed-batch 발효를 통한 반응기 내 고세포밀도 배양과 단백질 발현을 최적화하여 고농도의 글리콜산을 이론적 전환 수율 대비 63% 생산하였다 (23.6 mM). 마지막으로 대장균 내에 EcGCL과 EcFucO를 동시 발현한 새로운 전세포 생체 촉매 시스템에서는 에틸렌 글리콜을 66 %의 전환수율로 생산하였다 (6.6 mM). 이 연구는 대장균 내 포름알데히드로부터 글리콜산과 에틸렌글리콜을 환경친화적으로 합성하는 데 기여할 것이며, 나아가 녹색 경제의 지속가능성을 촉진하는 연구로 C1 화합물에서 고부가가치의 C2 화합물 합성 연구에 기여할 것이라 사료된다. ;Glycolic acid and ethylene glycol are high value-added two-carbon (C2) chemicals with various applications in industries including textiles, cosmetics, packaging and pharmaceutics. Since chemical process using fossil resource causes environmental pollution, research on the production of the chemicals from renewable biomass (e.g., xylose, glucose, and ethanol) using eco-friendly microbial biocatalyst system is being actively conducted. However, the mentioned substrates are the main carbon source in metabolic pathway. In this study, formaldehyde, which is receiving great attention as a one-carbon (C1) feedstock, was used as a substrate to minimize carbon loss in microbial cell factories Herein, we have constructed system for the productive whole-cell biocatalytic cascade reaction for glycolic acid and ethylene glycol from formaldehyde. A whole cell biocatalytic system included the design of the novel biotransformation pathway in Escherichia coli, selection of the cascade enzymes, balanced expression of the enzymes in E. coli, metabolic engineering of E. coli-based biocatalysts and bioprocess engineering. Glyoxylate carboligase from E. coli K-12 (EcGCL), which can convert various C2 chemicals from formaldehyde, has been engineered. EcGCLR484MN283QL478MM488L improved the catalytic efficiency of 9.2 M−1·s−1 by engineering the substrate entrance site and the active site based on the substrate docking simulation and crystal structure. Therefore, a novel whole cell biocatalytic system based on EcGCL for the synthesis of glycolic acid and ethylene glycol from formaldehyde via glycolaldehyde was designed. Intermediate (i.e., glycolaldehyde) was rapidly converted into glycolic acid and ethylene glycol by selecting suitable enzyme (i.e., Lactaldehyde dehydrogenase from E. coli (EcAldA), Lactaldehyde reductase from E. coli (EcFucO)) to alleviate the toxicity of aldehyde and to increase the conversion yield of target products. The metabolic pathways related to side reaction through BioCyc and KEGG genome/pathway databases was investigated. For the minimization of side reaction through the formaldehyde and glycolic acid degradation pathway, E. coli ∆frmA∆glcD strains were developed by using two-plasmid inducible CRISPR-Cas9 system. In addition, bioprocess engineering intermittently feeding formaldehyde into the reaction medium has been constructed and pH-stat glucose fed-batch fermentation was completed by optimizing high cell density culture and protein expression in a reactor, thereby producing a high concentration of glycolic acid. The engineered E. coli-based whole cell cascade reaction allowed to produce to conversion yield of glycolic acid was 63 % (i.e., 23.6 mM). In the novel whole cell biocatalytic system using the E. coli co-expressing EcGCL and EcFucO, ethylene glycol was produced to conversion yield of 66 % (i.e., 6.6 mM). This study will contribute to the environmentally friendly synthesis of glycolic acid and ethylene glycol from formaldehyde in E. coli, furthermore, promote the sustainability of the green economy.