Detection of Undeclared Egg and Milk Allergens using Immunological Method and Confirmation of Egg and Milk Proteins using LC-MS/MS

Abstract

Food allergy is an immunological adverse reaction against food proteins affecting various organs with symptoms and the prevalence of food allergies is nearly 5% of adults and 8% of children worldwide. The most evident management methods for food allergy are avoiding food containing allergens. However, food labels might not record allergen foods because of adventitious presence such as cross-contamination or incomplete labeling, which could be a serious problem to sensitive individuals with food allergy. In this study, undeclared milk and egg allergens were tested using commercial ELISA kits and LC-MS/MS analyses were performed for selecting marker peptides to confirm conflicting results from ELISA by quantification using marker peptides. Food samples with undeclared food allergens were purchased from local market. Urea buffer was used to extract egg and milk proteins. Extracted proteins were digested with trypsin and analyzed with PRM using LC-MS/MS. Peptides were finally selected based on the peak shape, intensity in the skyline and calibration curves. Selected marker peptides for milk were ‘ALLDPSFFAK’, ‘GYFQQYQPYQR’ and ‘FFVAPFPEVFGK’. Three marker peptides for egg, ‘GAIEWEGIESGSVEQAVAK’, ‘YNPTNAILFFGR’ and ‘AQSDFGVDTK' were selected. Among undeclared allergens analyzed with ELISA kits, 5 of 21 food products contained undeclared milk allergens and 9 of 29 food products contained undeclared egg allergens. Two of five milk products showed conflicting results which were positive or negative results depending on commercial ELISA kits. Six of nine egg products showed conflicting results which were positive or negative results depending on commercial ELISA kits. Two milk products and six egg products with conflicting results were further analyzed with LC-MS/MS. Two of five milk products and one of six egg products could be confirmed with quantification of milk and egg allergens. ;식품 알레르기는 인체의 다양한 기관에 증상이 발생할 수 있는 식품 단백질에 대한 면역학적 부작용이며, 전세계적으로 성인의 5%, 어린이의 8%의 유병률을 가지고 있다. 식품 알레르기의 가장 근본적인 관리 방법은 알레르기 성분이 포함된 음식을 섭취하지 않는 것이다. 그러나 식품 사이의 교차 오염과 같은 비의도적 혼입, 정확하지 않은 표기 등으로 인해 식품 라벨에 표시되어 있지 않은 알레르기 성분이 가공식품에 포함될 수 있으며, 이러한 미표시 알레르겐은 식품 알레르기 환자에게 심각한 문제를 초래할 수 있다. 본 연구에서는 미표시 우유, 계란 알레르겐이 들어있는 가공식품을 상업적 ELISA 키트로 검출하였고 우유와 계란 단백질의 마커 펩타이드를 선정하기 위해 LC-MS/MS 분석을 진행하였으며 최종적으로 선정된 마커 펩타이드를 이용한 정량시험을 진행하여 ELISA 키트 간의 상이한 결과를 확정 하였다. 미표시 알레르겐이 포함될 가능성이 있는 제품들은 서울 시내 대형마트 또는 백화점에서 구매하였으며, 우유와 계란 단백질을 추출하기 위해 Urea 용액을 사용하였다. 추출된 단백질은 트립신 효소로 가수분해하였고 LC-MS/MS의 PRM 분석으로 진행하였다. 마커 펩타이드는 Skyline 프로그램을 이용하여 peak의 트랜지션 모앙과 강도, 표준곡선의 직선성을 기준으로 선정되었다. 최종적으로 우유 마커 펩타이드는 ALLDPSFFAK, GYFQQYQPYQR와 FFVAPFPEVFGK을 선정하였으며 계란 마커 펩타이드는 GAIEWEGIESGSVEQAVAK, YNPTNAILFFGR와 AQS DFGVDTK이 선정하였다. ELISA 실험 결과, 21개 제품 중 5개 제품에서 미표시 우유 알레르겐이 검출되었고 29개 제품 중 9개 제품에서 미표시 계란 알레르겐이 검출되었다. ELISA 실험에서 검출 된 제품 중, 우유 2개 제품과 계란 6개의 제품이 세가지 상업적 ELISA 키트 간의 상이한 결과를 보였다. 이러한 결과를 LC-MS/MS 분석을 이용하여 선정한 마커 펩타이드로 정량분석을 하였고 3개 제품에서 마커 펩타이드가 정량 되었다. 우유 제품의 LC-MS/MS 분석 결과, ELISA 실험에서 상이한 결과를 보인 2개의 제품에서 모두 ALLDPSFFAK 펩타이드가 정량 되었으며, 정량 범위는 0.08-0.69 fmol 이다. 계란 제품의 LC-MS/MS 분석 결과, ELISA 실험에서 상이한 결과를 보인 제품 중 1개의 제품에서 GAIEWEGIESGSVEQAVAK 펩타이드가 0.07 fmol 정량 되었다. 본 연구를 통하여 상업적 ELISA 키트를 이용한 알레르기 유발물질 검사의 유용성을 확인 할 수 있었고, 개발한 LC-MS/MS 우유, 계란 알레르겐 검출법을 식품 중 미표시 알레르겐을 확인하는 데 적용할 수 있을 것으로 사료된다.