Detection of undeclared soybean and walnut allergens using immunological method and confirmation of soybean and walnut proteins using LC-MS/MS

Abstract

전세계적으로 식품 알레르기의 발생 빈도가 증가하는 추세이며, 미국 FDA와 USDA의 통계자료에 의하면 알레르겐 표시미비로 인한 리콜 사례가 매년 증가하고 있다. 본 연구에서는 가공식품 내에서 단백질을 추출하여 대두와 호두의 미표기 알레르겐을 상업적 ELISA 키트를 이용하여 비교분석했다. 미표기 알레르겐 검출 실험 결과, 대두가 미표기된 88개의 실험시료 중 6개에서 대두 알레르겐이 검출됬고, 호두가 미표기된 102개의 실험시료 중에서는 8개에서 호두 알레르겐이 검출됬다. 상업적인 ELISA 키트 간의 결과에서는, 대두 미표기 알레르겐이 검출된 6개의 시료들 중 1개의 가공식품과 호두 미표기 알레르겐이 검출된 8개의 시료들 중 4개의 가공식품의 결과가 다르게 나타났다. 검출된 호두 미표기 가공식품이 실제로 호두 알레르기 환자의 IgE와 반응하는지 알아보기 위하여 ELISA 방법으로 분석하고, 호두의 알레르기 원인 단백질을 확인하기 위하여 호두에서 단백질을 추출한 후 호두 알레르기 환자 혈청을 이용하여 western blot 실험을 진행했다. 그 결과, 해당시료와 환자혈청마다 각 가공식품 단백질과의 IgE 반응 정도가 다르게 나타났고, 환자의 혈청이 호두의 주요 알레르겐 중 하나인 Jug r 2와 반응하는 것을 확인했다. 미표기 대두 알레르겐이 검출된 시료들 중에서 상업적 ELISA 키트간에 결과가 다른 시료에 대두 알레르겐이 실제로 존재하는지를 확인하기 위하여 LC-MS/MS를 이용하여 분석했다. 또한, 대두와 호두 단백질을 추출한 후, LC-MS/MS로 분석하여 기 발표된 논문의 마커펩타이드와 일치하는 펩타이드의 존재를 확인했다. 세가지 상업적 ELISA 키트간 상반된 결과를 보인 대두 미표기 시료의 LC-MS/MS 분석결과, 2개의 대두 특이적인 펩타이드가 분석됬다. 또한, 대두와 호두 추출 단백질의 LC-MS/MS 분석 결과, 기 발표된 마커펩타이드 모두를 확인했다. 본 연구 결과를 통하여 상업적 ELISA 키트가 환자혈청보다 예민한 결과를 보일 수 있다는 것을 알 수 있었고, LC-MS/MS가 다른 면역학적 방법들 보다 양성오류(false positive)와 위음성(false negative)이 적으므로 대두와 호두 알레르겐을 명확하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 논문에서 확인한 마커펩타이드는 대두와 호두의 알레르겐 검출에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.;The frequency of food allergies worldwide is increasing, and according to statistical data from FDA and USDA, the number of recalls owing to undeclared allergens is increasing year by year. In this study, proteins were extracted from processed foods and undeclared allergens of soybeans and walnuts were analyzed using commercial ELISA kits. Soybean allergen was detected in six of 88 samples with undeclared soybeans. Among 102 samples of undeclared walnuts, walnut allergens were detected in eight samples. One processed food among the six samples with detected undeclared soybean allergen and four processed food among the eight samples with undeclared walnut allergen showed conflicting results among those from three commercial ELISA kits used. To investigate whether walnuts detected in undeclared processed foods actually react with the IgE of walnut allergy patients, analysis was conducted using the ELISA method. In addition, to identify the causal proteins of walnut allergens, western blot experiments were also carried out using walnut allergy patient’s sera after protein extraction from a walnut. The degree of IgE reactivity with each processed food protein differed for each patient’s serum when ELISA was performed. The western blot results of walnut protein showed that the patient's serum reacted with Jug r 2, one of the main allergens of walnuts. Among the samples in which an undeclared soybean allergen was detected, LC-MS/MS was performed to analyze whether soy allergens were actually present in the sample with conflicting result using three commercial ELISA kits. After extraction of soybean and walnut proteins, the presence of peptides which were consistent with the marker peptides of published papers was confirmed with LC-MS/MS analysis. Two soybean-specific peptides were analyzed through an LC-MS/MS analysis of undeclared soybean samples showing conflicting results among the three commercial ELISA kits. LC-MS/MS analyses of soybean and walnut proteins confirmed the marker peptides reported in published papers. The results of this study showed that commercial ELISA kits seem to be could sensitive enough to be used an allergen detection in food products. Soybean and walnut allergens can be clearly detected using LC-MS/MS, which gave fewer false-positives and false-negatives than using other immunological methods for the detection of soybean and walnut allergens. And the marker peptides identified in this study are expected to be useful for the confirmation of allergens in soybeans and walnuts.