Molecular characterization of a Phospholipase A2 from Sciscionella marina and its application to the liposome biotransformation

Abstract

Phospholipase A2 (PLA2) catalyzes hydrolysis of the ester linkage in the sn-2 position of phospholipids, generating lysophospholipids and free fatty acids. Since most microbial PLA2s were rather unstable for commercial application, a novel thermostable PLA2 from marine bacterium Sciscionella marina (SmPLA2) was discovered. According to the X-ray crystallographic study by Prof. Cha, the enzyme consists of five α-helices and contains four cysteine residues and one Ca2+ binding site. SmPLA2 exhibited rather high thermostability up to 50 °C, which is significantly greater than the representative bacterial PLA2 from Streptomyces violaceoruber (SvPLA2) and a porcine pancreatic PLA2 (ppPLA2). The SmPLA2 showed high biotransformation activity. For instance, the enzymes allowed to produce 66 g/L of lysophospholipids and 37 g/L of free fatty acids from 200 g/L crude soybean lecithin within 3 h. The dynamic light scattering (DLS) analysis revealed that the products existed in the form of liposomes, ranging 106 nm in diameter for 2 mL reaction and 156 nm in diameter for 25 mL reaction, which were stable for 2 weeks. The lysolecithin liposomes including linoleic acid and oleic acid showed high antimicrobial activity against Porphyromonas gingivalis, which is involved in periodontitis in oral cavity. The free fatty acids appeared to be efficiently transported into the cellular membranes of P. gingivalis, resulting in permeabilization of the cell membranes. This study will contribute to industrial application of PLA2 for valorization of lecithins and phospholipids.;포스포라이페이즈 A2 (PLA2)는 레시틴의 두 번째에 위치하는 지방산 에스터 결합을 가수분해하여 지방산과 라이소레시틴을 생성하는 효소이다. 이 효소는 식용 오일의 탈검 과정에 사용되고, 생성된 라이소레시틴은 레시틴 보다 향상된 유화 기능을 가지며, 유화제, 보존제 및 항균제로서 식품, 화장품 및 제약 등 다양한 산업에서 이용될 수 있다. 효소를 이용한 생물 공정에 있어 가장 중요한 것은 효소의 안정성이다. 고온의 효소 반응은 생산 수율을 높일 수 있고, 효소의 기질 용해도 및 반응 용액의 점성을 감소시키는 장점이 있기 때문에 열 안정성이 높은 신규 SmPLA2가 발굴되었다. 그러나 효소의 3차 구조가 없었기 때문에 여러 한계가 있었다. 따라서 본 연구에서는 SmPLA2 효소의 특성을 연구하기 위해 3차 구조를 규명하였고, 구조적인 특성을 분석하였다. SmPLA2는 5개의 알파 헬릭스와 4개의 시스테인 아미노산 잔기 및 칼슘 이온 결합 위치를 가지고 있었다. SmPLA2는 구조적인 안정성을 가지기 때문에 SvPLA2와 ppPLA2 효소에 비해 50 ℃의 고온에서도 높은 열 안정성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 SmPLA2는 생물 공정에서 다른 효소들 보다 높은 효소 활성을 나타냈다. 200 g/L의 레시틴 가수분해 반응 결과 67 g/L의 라이소레시틴과 37 g/L의 지방산들이 생성되었다. 생성된 라이소레시틴은 레시틴에 비해 수용성을 나타내므로 수용액 상에서 지방산을 함유하는 리포좀 또는 마이셀을 형성할 수 있다. 따라서 동적광산란(DLS) 방법을 이용하여 생성물의 평균 직경을 측정함으로써 입자의 안정성을 평가했고, 그 결과 리포좀 또는 마이셀이 2 mL 부피의 반응에서 평균 106 nm, 25 mL 부피의 반응에서 평균 156 nm로 2주간 안정한 형태를 유지하는 것을 확인하였다. 또한 이 리놀레산 및 올레산을 함유하는 라이소레시틴 리포좀은 구강 내 치주염의 원인균인 폴피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis)의 증식을 효과적으로 억제하는 항균 효과를 보였다. 이는 지방산이 안정한 리포좀 또는 마이셀 형태로 P. gingivalis에 효율적으로 도달하여 세포막 내로 투과되는 것으로 나타났다. 그러므로 높은 내열성을 갖는 SmPLA2와 이를 통해 생성된 라이소레시틴 리포좀이 산업적으로 유용하게 이용될 것이다.