β-catenin blockers enhance the effect of CDK4/6 inhibitors on stemness and proliferation inhibition in endocrine resistant breast cancer cells

Abstract

Wnt/β-catenin signaling plays an important role in endocrine resistance in hormone receptor-positive breast cancers. Palbociclib is a well-known cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitor (CDK4/6 inhibitor) that downregulates the activation of retinoblastoma molecules to inhibit the cell cycle in breast cancer cells. This study investigated the dual inhibitory effects of the CDK4/6 inhibitor palbociclib and the β-catenin small-molecule inhibitor ICG-001 in tamoxifen-resistant breast cancer cell lines. Tamoxifen-resistant MCF-7 (TamR) cells were established by continuously exposing MCF-7 to tamoxifen. The characteristics associated with cancer stemness were clarified by western blotting, cell cycle analysis, and mammosphere assay. The combined effects of palbociclib and ICG-001 were tested in control MCF-7 and endocrine-resistant cell lines. TamR cells showed elevated protein (Nanog, Sox2, ALDH1 and p-STAT3) levels, indicating stem cell characteristics, and elevated β-catenin activity compared with those in control cells. TamR cells also showed significantly higher mammosphere-forming efficiency. Several stemness markers decreased when palbociclib and ICG-001 were combined in TamR cells. There was a greater reduction in stemness markers when treated with palbociclib and ICG-001 combination than when treated with either palbociclib or ICG-001 alone (combination index (CI) value in palbociclib 25 μM and ICG-001 50 μM was 1.1 ± 0.02). TamR cells treated with palbociclib and ICG-001 in combination demonstrated significantly reduced cell proliferation and mammosphere-forming efficiency compared with those treated with either palbociclib or ICG-001. The combination of both drugs could additively inhibit proliferation and suppress stemness characteristics. These results suggest that β-catenin plays a role in endocrine-resistant breast cancer; the double inhibition of β-catenin and CDK4/6 can overcome endocrine resistance in breast cancer cells.;유방암은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR)와 사람 표피성장인자 수용체 2 (human epidermal growth factor receptor-2, HER2)의 발현에 따라 여러 아형으로 나뉘는 이질적인 질환으로, 이 중 호르몬 수용체 양성 유방암은 전체 유방암 환자의 약 70%를 차치하고 있다. 타목시펜(tamoxifen)은 호르몬 수용체 양성 유방암에서 효과적인 것으로 보고된 1차 호르몬 치료제이지만, 타목시펜을 투약한 환자의 약 20%가 질병의 재발 또는 진행을 경험한다. 지금까지 알려진 호르몬 치료제의 내성기전으로는 ER 발현의 상실, ER을 코딩하는 유전자의 돌연변이, 성장 인자 신호 전달 경로(growth factor signaling pathways)의 과활성화, 세포 주기 신호 전달 경로의 조절 장애가 있으며, 최근 연구들에 따르면 Wnt/β-catenin 신호전달이 호르몬 수용체 양성 유방암에서 호르몬 치료 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 또한 유방암에서 β-catenin 신호전달의 활성화는 세포 성장, 증식 및 분화에 중요한 역할을 하며, 유방암의 줄기세포의 수, 종양 개시 능력 및 전이와 관련이 있는 것으로 입증되었다. 팔보시클립(palbociclib)은 잘 알려진 사이클린 의존성 키나아제 4 및 6 (CDK4/6) 억제제로 망막모세포종(Rb) 분자의 활성화를 하향 조절하여 유방암 세포의 세포 주기를 억제하는 기전을 가지며, 호르몬 치료 내성을 극복하고 치료 효과를 높일 수 있는 1차 치료제로 도입되고 있다. 또한 CKD4/6 억제제의 효능을 증가시키기 위해 호르몬 내성 환경에서 두 가지 다른 CDK4/6 억제제의 사용, CKD4/6 억제제와 에스트로젠 수용체 하향조절제인 풀베스트란트(fulvestrant)를 조합하는 등 여러 치료 조합이 연구되고 있다. 이에 본 연구는 타목시펜(tamoxifen) 내성 유방암 세포주의 특성을 확인하고 CDK4/6 억제제인 팔보시클립과 β-catenin 소분자 억제제인 ICG-001의 치료 조합 효과를 조사하였다. 사람 호르몬 양성 유방암 세포주인 MCF-7에 타목시펜을 지속적으로 노출시켜 호르몬 내성 MCF-7(TamR) 세포주를 제작하였다. 암 줄기세포와 관련된 특성은 Western blot, luciferase assay 및 mammosphere assay를 통하여 확인하였다. TamR 세포는 MCF-7 세포와 비교하여 암 줄기세포의 특성을 가지는 마커들과 세포 신호전달 경로와 관련된 단백질 발현이 증가하였으며(Nanog, Sox2, ALDH1 및 STAT3, p-STAT3), β-catenin의 활성도 높았다. TamR 세포는 또한 훨씬 더 많은 sphere form을 보였다. Cell viability assay를 통해 팔보시클립과 ICG-001의 적절한 치료 농도를 정하였고, 두 약제를 조합하여 치료하였을 때 combination index 1.1 ± 0.02로 부가적인 효과(additive effect)를 보이는 것을 확인하였다. 팔보시클립과 ICG-001의 조합 치료 시 mammosphere 형성이 현저히 감소하였으며, 여러 줄기성(stemness) 마커들(Nanog, Sox2, ALDH1)의 단백질 발현이 줄어들었다. 또한 active β-catenin과 p-STAT3의 경우 조합 치료 시 유의미한 발현 감소를 보여 p-STAT3를 포함한 세포 신호전달 경로와 조합 요법을 통한 active β-catenin 감소가 호르몬 내성 세포의 줄기능력(stemness) 감소와 관련이 있음을 강하게 추정하였다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 타목시펜 내성 유방암 세포주에서 암 줄기세포와 관련된 특성과 Wnt/β-catenin 신호전달 경로가 활성화되는 것을 확인하였으며, 팔보시클립에 ICG-001을 조합하는 요법이 active β-catenin 감소와 함께 STAT3 신호전달 경로에 영향을 미쳐 부가적인 항종양 효과를 보임을 확인하였다. 또한 β-catenin과 CDK4/6의 이중 억제가 호르몬 내성 유방암 세포에서 세포 성장과 줄기세포 특성을 줄이는 새로운 보조 치료 전략이 될 수 있음을 제시하였다.