Biotransformation of Fatty Acids by using Outer Membrane Vesicles of Escherichia coli containing Fatty Acid Hydratases and/or Decarboxylases

Abstract

Outer membrane vesicles (OMVs) of the gram-negative bacteria are unilamellar proteoliposomes (20-200nm) which are consisted of outer membrane proteins, lipopolysaccharide (LPS) and phospholipid. OMVs are generated naturally during the growth of gram-negative bacteria and they contain DNA, RNA and periplasmatic proteins. These structures are known to play important role such as exporting virulence factors or communicating between cells. Herein, I constructed the novel system for biotransformation of fatty acids via engineered OMVs of Escherichia coli as a nano-scale biocatalyst. An oleate hydratase from Stentrophomonas maltophilia (SmOhyA) and/or a photoactivated fatty acid decarboxylase of Chlorella variabilis NC64A (CvFAP) were targeted into engineered OMVs. With the signal sequence of pectate lyase B from Erwinia carotovora (PelB), each enzyme was directed to the periplasm for efficient inclusion into the OMVs. Oleic acid was converted into (R)-10-hydroxyoctadecanoic acid via OMVs containing SmOhyA. The specific biotransformation rate of the SmOhyA encapsulated in the OMVs were approximately 30-fold higher than those of the enzymes in the recombinant E. coli whole-cells. Moreover, CvFAP-containing OMVs catalyzed the reaction of oleic acid into (Z)-heptadec-8-ene and also the cascade reaction was performed by the OMVs containing both SmOhyA and CvFAP to convert oleic acid into 9-hydroxyheptadecane via (R)-10-hydroxyoctadecanoic acid. All the cases showed that the specific volumetric activity of OMVs was about 1000 ~ 2000 times higher than that of E. coli cells. ;그람 음성 균의 세포막 구조는 세포 내막(inner membrane)과 세포 외막(outer membrane), 그리고 그 사이의 페리플라즘 내의 펩티도글리칸 층으로 이루어져 있다. 그람 음성 균의 outer membrane vesicles, 즉 OMVs는 세포 외막이 페리플라즘 성분들을 포함한 채 형성되는 20~200nm의 구형 소낭이다. OMVs는 세포 외막을 이루는 단백질과 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)로 구성되어 있으며, 그 내부에 세포의 능동적 선택 기작에 의해 단백질, 지질, DNA 등의 필요 물질들을 포함하며 발생된다. 본 연구에서는 OMVs를 통해 미생물 세포 내 물질을 외부로 분비할 수 있다는 점을 착안하여, 대장균의 OMVs를 새로운 나노 스케일 바이오카탈리스트로 이용한 의 지방산 생물 전환 시스템을 구축하였다. 이를 위해, 대장균의 OMVs 내에 Stenotrophomonas maltophilia 유래의 지방산 이중결합 수화효소 (SmOhyA)와 Chlorella variabilis NC64A 유래의 지방산 탈탄산효소 (CvFAP)를 각각 혹은 함께 발현시켜주었다. 각 효소들은 Erwinia carotovora 유래의 PelB 시그널 펩타이드와 함께 발현시켜 페리플라즘으로 유도하였다. OMVs 내에 포함된 SmOhyA의 수화 반응을 통해 oleic acid로부터 (R)-10-hydroxyoctadecanoic acid를 생성하였다. 이 결과를 대장균 전세포 바이오 생촉매를 이용한 결과와 비교하였을 때, 동일한 양의 효소에 대하여 약 30배 정도 높은 생물 전환 속도를 나타낸 것을 확인하였다. 이는 나노 크기의 OMV가 소수성의 기질과 빈번한 상호작용을 통해 빠르게 효소-기질 복합체를 형성하였기 때문이라고 설명할 수 있다. 또한 OMVs 시스템의 경우 효소가 이중막의 세포 외막에 둘러싸인 구조이기 때문에 효소의 안정성 측면에서도 유리한 것으로 확인되었다. SmOhyA 외에도 OMV- CvFAP 의 탈탄산 반응을 통해 oleic acid로부터 (Z)-heptadec-8-ene를 생성하였으며, SmOhyA와 CvFAP의 두 가지 효소를 OMVs 내에 한번에 발현시킨 후 진행한 2 단계 생물전환 반응 역시 성공적으로 생성물을 생성한 것을 확인할 수 있었다. 다만, 5,8-이수산화 합성효소 (diol synthase)의 경우, 페리플라즘으로 발현시켰을 때 생물 전환 속도가 약 10배 정도 향상된 결과를 얻을 수 있었으나 효소의 크기가 100kDa 이상으로 OMVs 내에 포함되는 것에 한계가 있는 것으로 보인다. 또한, OMVs를 산업적으로 이용하기 위해, 대장균의 OMVs 생산량 향상을 위한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이 연구는 대장균의 OMVs 내에 한 가지 이상의 효소를 발현시켜 지방산 생물전환 시스템의 새로운 생촉매로써의 가능성을 확인하였다. 따라서, 지방산의 낮은 용해도에 의한 한계를 극복하는 데에 새로운 나노 스케일의 효소 시스템이 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.