전장유전체 분석을 이용한 콜리스틴 내성 Acinetobacter baumannii 균의 분자유전학적 내성 기전 및 역학에 관한 연구

Abstract

Acinetobacter baumannii는 병원 환경에 광범위하게 분포하고 있으며, 의료 관련 감염의 중요한 원인균으로 콜리스틴(colistin)을 포함한 다양한 항균제에 내성을 보인다. 차세대 염기서열 분석법(NGS; next generation sequencing)은 기존의 방법보다 상대적으로 빠르고, 한 번의 프로토콜로 병원체에 대한 동정과 타이핑, 병원체 간의 유전적 관계 확인, 병원체 전파경로 추정, 항균제 내성 유전자 확인 등이 가능하여 임상미생물 검사 및 연구 영역에서 유용하게 활용할 수 있다. 본 연구는 차세대 염기서열 분석법을 이용한 전장유전체 염기서열 분석(WGS; whole genome sequencing)을 통해 콜리스틴 내성 A. baumannii의 내성 기전을 규명하고 콜리스틴 내성 A. baumannii의 분자 역학을 분석하여 콜리스틴 내성 A. baumannii의 전파 기전과 위험인자를 파악하고자 한다. 2014년 1월 1일부터 2018년 12월 31일까지 이화여자대학교 의과대학 부속 목동병원에 내원한 환자의 다양한 검체에서 분리된 A. baumannii 균주 중 콜리스틴 내성을 보였던 균주 51개와 감수성 균주 100개를 선정하고 균주가 분리된 환자들을 대상으로 콜리스틴 내성 A. baumannii 감염의 임상적 위험 인자를 분석하였다. 이후 VITEK2 시스템(bioMerieux, Marcy I'`Etoile, France)을 이용한 항균제 감수성 검사에서 콜리스틴 내성을 보인 48개의 균주와 대조군으로 선정한 11개의 감수성 균주를 대상으로 Sensititire 시스템(Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA)을 이용하여 콜리스틴 내성 검사를 시행하였다. 또한 VITEK2 시스템의 항균제 감수성 결과에서 콜리스틴에 대한 최소발육저지농도(MIC; minimum inhibitory concentration) 값이 높은 내성 균주 30개에 대해 전장유전체 분석과 비교유전체 분석(comparative genomic analysis)을 시행하였다. 콜리스틴 내성 균주를 대상으로 하였을 때, VITEK2 시스템과 Sensititre 시스템의 일치율(essential agreement)은 85.4% (41/48)이며, 범주 일치율(categorical agreement)은 97.9% (47/48)로 이전의 연구들과 유사한 결과를 보이며 신뢰성 있는 결과를 보여주었다. 전장유전체 염기서열 분석 결과 27개 균주는 A. baumannii로, 나머지 3개 균주는 Acinetobacter colistiniresistens로 동정되었으며, 콜리스틴 내성과 관련된 것으로 알려진 lpxA, lpxC, lpx D, pmrA, pmrB, mcr1의 유전자 돌연변이는 모두 검출되지 않았다. 비교유전체 분석은 참조 유전체와 전체 유전체와의 염기서열 비교를 통하여 비교 대상의 다른 표현형에 대한 원인 유전자를 발굴하거나, 특정 군이 공통적으로 가지는 유전체적 특징을 찾아낼 수 있는 기법이다. 다제내성균을 대상으로 비교유전체 분석을 시행할 경우, 종간의 유전적 진화 관계뿐 아니라 내성 유전자의 획득이나 축적을 포함한 진화적 기전, 독성(virulence)과 내성 간의 진화적 교환(trade-off)에 관한 탐구, 내성균의 확산 추적, 병원균의 숙주 내 진화에 대한 모니터링이 가능하다. 본 연구에서는 콜리스틴 내성 A. baumannii에 대하여 콜리스틴 감수성 A. baumannii ATCC 17978 표준 균주를 참조 유전체로 선정하여 비교유전체 분석을 시행하였을 때, 차이를 보이는 coding sequence(CDS)는 57개이었고, 이중 이름과 기능이 알려진 CDS는 13개로 포함되는 유전자는 21개이었다. 이 유전자들 중, cysH, udg, ureC, DNMT1, dcm의 5개의 유전자는 A. colistiniresistens와 동시에 검출되었고, 나머지 16개의 유전자는 A. baumannii 에서만 검출되었다(tmk, DTYMK, glxK, garK, CHO1, pssA, mdh, udg, mutY, TST, MPST, sseA, cobS, cobV, ENOm, eno). 이들 유전자는 현재까지 콜리스틴 내성과 연관성이 있다고 알려져 있지 않다. 따라서 비교유전체분석에서 차이를 보이는 CDS중 아직 이름과 기능이 알려지지 않은 새로운 유전자가 콜리스틴 내성에 관여했을 것으로 생각되며 이에 대한 추가 연구가 필요하다. 전장유전체 다자위 서열 형별 분석(wgMLST; whole-genome multi-locus sequence typing) 및 단일염기다형성 분석(SNP analysis; single nucleotide polymorphism analysis)을 바탕으로 보았을 때, 이번 연구에 포함된 콜리스틴 내성 A. baumannii 균주(strain)는 2개의 군집(cluster)으로 나뉘어진 것으로 보였으나 두 군집간의 검출 시기나 검체, 항균제 내성 패턴 및 환자군 특징의 차이는 없었다. 옥스포드 방법(Oxford scheme)에 따른 전통적 다자위 서열 형별 분석(conventional MLST)에서는 ST1809, ST451, ST191, ST1837, ST369로 타이핑 되었으며, 전장유전체 다자위 서열 형별 분석이나 단일염기다형성 분석의 결과와는 연관성이 없었다. 본 연구에서 검출된 ST451, ST191, ST369는 global clone 2(GC2)에 포함되어 있다. GC2는 대부분의 카바페넴(carbapenem) 내성 A. baumannii가 포함되어 있으며, OXA-23 carbapenemase와 연관되어 있다. 콜리스틴 내성 A. baumannii 감염의 임상적 위험인자를 알아보기 위해 단변량 분석을 시행하였고 호흡기계 질환의 기왕력(P=0.017), 균 분리 전 재원 기간(P =0.004), 중환자실 입원력(P=0.020), 이전의 기계 호흡(P=0.003), 기관절개술(P=0.043), 경피적 농양배액술 시행(P=0.070), 혈액 투석(P=0.002), 콜리스틴 항균제 사용력(P<0.05), 카바페넴 계열 항균제 사용력(P<0.05), 테이코플라닌(teicoplanin) 사용력(P=0.004), 중복 감염(P=0.035)이 콜리스틴 내성군과 감수성군에서 차이를 보였다. 그러나 다중회귀분석을 시행한 결과 테이코플라닌 사용력(OR, 3.140; 95% CI, 0.529-18.650; P=0.208), 이전의 혈액투석(OR, 2.722; 95% CI, 0.851-8.709; P=0.091), 호흡기계 질환의 기왕력(OR, 2.286; 95% CI, 0.998-5.283; P=0.053), 카바페넴 계열 항균제 사용력(OR, 0.199; 95% CI, 0.863-5.603; P=0.099), 중복 감염(OR, 1.706; 95% CI, 0.746-3.898; P=0.205), 이전의 기계 호흡(OR, 1.614; 95% CI, 0.684-3.809; P=0.275), 중환자실 입원력(OR, 1.387; 95% CI, 0.560-3.435; P=0.480), 이전의 기관절개술 (OR, 1.102; 95% CI, 0.344-3.527; P=0.870)이 콜리스틴 내성균 감염의 위험도를 높이는 것으로 분석되었으나 모두 통계학적으로 유의하지는 않았다. 본 연구의 의의는 다음과 같다. 첫째, 내성 유전자 분석을 통해 현재까지 콜리스틴 내성과 연관성이 있다고 알려져 있지는 않으나 콜리스틴 내성과 연관 가능성이 있는 후보 유전자를 확인 할 수 있었다. 둘째로 국내 최초로 전장유전체 분석을 이용한 콜리스틴 내성 A. baumannii의 분자역학을 통해 국내 분리 균들에 대한 특성을 분석하여 내성균 역학에 대한 기초자료로 활용 할 수 있다. 셋째로 콜리스틴 내성 A. baumannii 의 위험 인자를 분석하여 호흡기계 질환의 기왕력, 중환자실 입원력, 이전의 기관절개술, 기계 호흡, 혈액 투석, 균 검출 28일 이내 카바페넴 계열 항균제 사용력, 테이코플라닌 사용력, 중복 감염이 콜리스틴 내성균 감염의 위험도를 높일 수 요인으로 고려해 볼 수 있음을 제시하였다. ;Acinetobacter baumannii is an important nosocomial pathogen and is resistant to most antimicrobial agents, including colistin in the hospital setting. Next generation sequencing (NGS) determines the DNA sequence of a complete bacterial genome in a single sequence run and from these data information on resistance and virulence as well as information for identification and typing is obtained. In this study, molecular mechanisms and epidemiology of colistin resistant A. baumannii isolates from various clinical specimens were characterized. One hundred colistin susceptible A. baumannii and fifty one colistin resistant A. baumannii identified by VITEK2 system (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) from various patient`s specimens from January 2014 to December 2018 from EWHA Womans University Mokdong Hospital were included in this study. The Sensititre system (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were used to confirm colistin resistance. In colistin resistance testing, 48 colistin resistant isolates and 11 colistin susceptible isolates were included. Out of 48 colistin resistant A. baumannii isolates, 30 A. baumannii strains were selected for whole-genome sequencing. Rates of essential agreement of colistin susceptibility test results between Sensititre and VITEK2 was 85.4% (41/48) and the categorical agreement was 97.9% (47/48), respectively. Similar to previous study, the Sensititre method shows good categorical agreement with VITEK2 methods for susceptibility testing of colistin resistance in A. baumannii. In whole genome sequencing, three out of 30 A. baumannii were identified as Acinetobacter colistiniresistens. The mutations that could be responsible for colistin resistance such as lpxA, lpxC, lpxD, pmrA, pmrB, ispB and mcr1 genes were not observed in all 30 isolates. Comparative whole-genome sequence analysis of multidrug resistant bacterial strains has enabled phylogenetic studies into the evolutionary mechanisms involved in acquisition and accumulation of antibiotic resistance genes, including studies exploring evolutionary trade-offs between virulence and resistance; tracking the spread of resistant pathogens, or monitoring within-host evolution of pathogens. According to the comparative genomics, colistin sensitive A. baumannii ATCC 17978 and resistant A. baumannii showed differences in 57 coding sequence (CDS). The gene names and functions were known in 13 CDS (included 21 genes). Out of 21 genes, 16 genes (tmk, DTYMK, glxK, garK, CHO1, pssA, mdh, udg, mutY, TST, MPST, sseA, cobS, cobV, ENOm, eno) were showed only in A. baumannii and the other 5 genes were also showed in A. colistiniresistens. Among them, the mutations that could be responsible for colistin resistance were not observed. Therefore unknown genes were responsible for colistin resistance. Further study is needed. Results of the whole-genome multilocus sequence typing (MLST) and phylogenetic tree using Single nucleotide polymorphism (SNP) analysis showed that colistin resistant A. baumannii strains were classified into 2 clusters, but there were no differences of clinical characteristics and antimicrobial resistance patterns between 2 clusters. Conventional MLST was followed through the Oxford scheme. All isolates belonged to global clone 2 (GC2) and revealed sequence type (ST), ST1809, ST451, ST191, ST1837 and ST369. There was no association between conventional MLST and wgMLST or SNP analysis. A. baumannii ST451, ST191 and ST369 are included in global clone 2 (GC2). Most carbapenem resistant A. baumannii belonged to GC2, and the GC2 was associated with OXA-23 carbapenemase production. Compared with patients with colistin sensitive infections, patients with colistin resistant A. baumanni infections had a combined pulmonary disease (P=0.017), intensive care unit stay (P=0.020), prior mechanical ventilation (P=0.003), prior tracheostomy (P=0.043), prior percutaneous drainage (P=0.070), prior hemodialysis (P=0.002), prior use of colistin (P<0.05), carbapenem (P<0.05) and teicoplanin (P=0.004) and co-infection (P=0.035) by univariate analysis. Variables significantly associated with colistin resistantA. baumanni infections in univariate analysis were entered into a multivariate analysis. Multivariate analysis indicated that eight variables were related to the likelihood of colistin resistant A. baumanni infections: use of teicoplanin (OR, 3.140; 95% CI, 0.529-18.650; P=0.208), prior hemodialysis (OR, 2.722; 95% CI, 0.851-8.709; P=0.091), combined pulmonary disease (OR, 2.286; 95% CI, 0.998-5.283; P=0.053), prior use of carbapenem (OR, 0.199; 95% CI, 0.863-5.603; P=0.099), co-infection (OR, 1.706; 95% CI, 0.746-3.898; P=0.205), prior mechanical ventilation (OR, 1.614; 95% CI, 0.684-3.809; P=0.275), intensive care unit stay (OR, 1.387; 95% CI, 0.560-3.435; P=0.480), prior tracheostomy (OR, 1.102; 95% CI, 0.344-3.527; P=0.870), but there was no statistic differences. The significance of this study is as follows. First, we identified candidate genes that are not known to be related with colistin resistance but are likely to be associated with colistin resistance. Second, we analyze the characteristic of colistin resistant A. baumannii isolates by WGS for the first time in Korea. And it can be used as a basic information on molecular epidemiology of colistin resistant A. baumannii. Third, we identified possible risk factors for colistin resistant A. baumannii infection such as combined pulmonary disease, intensive care unit stay, tracheostomy, mechanical ventilation, hemodialysis, prior use of carbapenem or teicoplanin, co-infection.