Bioprocess Engineering for the Extracellular Production of the Microbial Phospholipase A2s and for the Hydrolysis of Lecithin

Abstract

포스포라이페이스 A2 (PLA2)는 레시틴(1)의 sn-2 위치의 에스테르 결합을 가수분해하여 라이소레시틴(2)과 유리 지방산을 생성하는 효소이다. 라이소레시틴(2)은 유화제 및 항균제로 작용하여 식품, 화장품 및 제약 등의 산업에서 이용될 수 있는 유용한 물질이다. 따라서 본 연구는 대두, 난황 등에 흔히 존재하는 레시틴(1)으로부터 PLA2를 이용하여 고부가의 라이소레시틴(2)을 생산하는 생물전환 경로에 관심을 가졌으며 이를 한층 개선된 경로로 디자인하였다. 본 연구에서는 대표적인 미생물 유래 PLA2인 Streptomyces violaceoruber PLA2 (SvPLA2)와, 내열성이 높으며 신규 PLA2인 Sciscionella marina PLA2 (SmPLA2)를 재조합 대장균을 이용해 생산하고자 했으며 스케일업 배양을 통해 보다 고농도로 해당 효소를 생산하였다. 재조합 대장균의 PelB signal sequence 기반 발현 시스템은 PLA2가 세포 밖으로 분비되도록 유도하였으며, 이는 활성형의 효소를 수득하기에 용이하고 단백질의 정제공정이 간소화된다는 장점을 가져 이를 고농도 세포 배양과 융합할 시 대규모 효소 생산에 적합하다. 따라서 생물반응기를 이용한 유가식 배양을 통해 재조합 대장균을 고농도로 배양하였으며, 배양공정의 디자인을 통해 PLA2의 분비량을 증가시킬 수 있었다. 배양액을 원심분리하여 상층액을 분리, 이를 효소 용액으로 이용하였을 때 SvPLA2의 경우 회분식 배양에 비해 배양액 부피당 1.7배, SmPLA2의 경우 4.7배 높은 효소 활성을 갖는 것을 확인하였다. SmPLA2의 배양액을 이용하여 100 g/L의 레시틴(1)의 가수분해 반응 결과 대부분이 분해되어 약 50 g/L의 라이소레시틴(2)과 28 g/L의 리놀레산(3)이 생성되었다. 또한, 이러한 PLA2 기반 생물전환 공정을 한 차원 더 발전시키기 위해, 고부가 라이소레시틴(2)과 함께 생성되는 부산물인 리놀레산(3)을 이용하여 고부가 물질을 생성하고자 했다. 이에 또 다른 효소를 접목시킨 다단계 생물전환 경로를 디자인하였으며, 불포화 장쇄 지방산의 수화반응을 촉매하는 oleate hydratase (OhyA2)와 탈탄산 반응을 촉매하는 photodecarboxylase (CvFAP)를 PLA2의 생물전환 반응에 접목하여 바이오연료 등에 활용 가능한 다용도의 알켄을 생산하고자 했다. 따라서 이를 과발현시킨 재조합 대장균을 기반으로 whole cell biocatalyst를 구축하였으며, one cell 및 two cell biocatalyst를 이용한 생물전환을 통해 리놀레산(3)으로부터 고부가 알켄인 6,9-heptadecadiene(4)과 9-hydroxy-11-heptadecene(6)을 약 91%, 85%의 수율로 생산하였다. 이처럼 whole cell biocatalyst를 이용한 다단계 생물전환 경로를 디자인으로써 레시틴(1)으로부터 고부가 라이소레시틴(2)과 다양한 알켄을 생산하는 업그레이드된 PLA2 기반 생물전환 공정을 구축할 수 있었다.;Phospholipase A2 (PLA2) is an enzyme that hydrolyzes the fatty acid ester bond at the sn-2 position of lecithin generating lysolecithin and free fatty acids. In this study, extracellular production of soluble Streptomyces violaceoruber PLA2 (SvPLA2), which is one of the representative microbial PLA2, as well as a novel Sciscionella marina PLA2 (SmPLA2) was investigated. Overproduction of the PLA2s was exploited by using Escherichia coli-based microbial cell factory. The pelB signal sequence-based expression system for PLA2s facilitated not only intracellular expression but also extracellular secretion of the enzymes. The fed-batch cultivation of the recombinant E. coli expressing SvPLA2 allowed to produce SvPLA2 to an activity of 8.3 U per mL culture broth. This is comparable to the batch cultivation which produced the SvPLA2 to an activity 4.9 U per mL culture broth. The similar process using the recombinant E. coli expressing SmPLA2 resulted in an activity of 11.2 U per mL culture broth. It was the 4.1-fold higher value than the batch cultivation of SmPLA2. The hydrolysis of soybean lecithin by using the SmPLA2, which had been produced from the fed-batch cultivation, was also investigated. The hydrolysis reaction of 100 g/L crude soybean lecithin under 50℃, which was the optimum temperature, allowed to produce the corresponding lysolecithin and linoleic acid to a concentration of 100 mM (50 g/L of lysolecithin and 28 g/L of linoleic acid). The conversion yield was estimated to about 100 %. These results could contribute to industrial production of lysolecithin from lecithin.