Screening and Evaluation of Anti-RANKL(Receptor Activator of NF-kappaB Ligand) Antibodies

Abstract

RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κ B ligand)은 조골세포 표면에 발현되는 단백질 중 하나로, 파골 세포의 전구체 표면에 존재하는 RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor κ B)에 결합하여 파골 세포 전구체가 파골 세포로 분화될 수 있도록 한다. RANKL의 과다 분비는 골다공증, 류마티스 관절염 그리고 RANK 신호전달과 관련된 암의 발생 등 여러 질환을 일으킬 수 있다. 이전 연구에서 파지 디스플레이를 통해 인간 항체 라이브러리로부터 RANKL에 효과적으로 결합하는 scFv 항체인 4D3를 선별하였으나 면역글로불린 형태로 바꾸었을 때 결합능력을 상실함을 확인한 바 있다. 이는 선별된 항체의 중쇄 가변영역의 항원상보성결정부위 (CDR)에 존재하는 N-글리코실화 서열이 원인인 것으로 생각된다. 따라서, 이 연구에서는 선별되었던 scFv 항체의 N-글리코실화 서열의 아미노산을 바꾼 클론들로부터 다시 RANKL에 효과적으로 결합하는 항체들을 선별하고, 면역글로불린 형태로 클로닝하여 마우스 유래 RANKL과 인간 유래 RANKL에 대한 결합능력을 확인하였다. N-글리코실화 서열의 아미노산을 바꾼 돌연변이체 중 기존 항체만큼 높은 결합능력을 가지면서 N-글리코실화 서열을 갖지 않는 두 개의 클론을 선별하였고, 면역글로불린으로 클로닝 하였을 때 결합 능력을 상실하는 기존 항체에 반해 마우스 RANKL과 인간 RANKL 모두에 대해 높은 결합 능력을 유지하는 것을 확인하였다. 또한 선별된 항체 중 아스파라긴 대신 트레오닌 아미노산을 갖는 돌연변이 항체를 처리하였을 때 RANKL에 의한 파골 세포 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로, 글리코실화에 의한 CDR의 구조 변화에 의해 항체의 결합능력이 영향을 받았음을 확인할 수 있고, 새롭게 선별된 RANKL 항체는 치료용 항체로서의 가능성을 가지며 추가적인 특성 연구와 항체 활성의 검증 및 최적화를 통하여 뼈와 관련된 질병 연구에 유용하게 쓰일 것으로 생각된다.;RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) is a member of TNF (tumor necrosis factor) superfamily and is expressed by osteoblasts and other tissues. RANKL binds to RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor κB) expressed on osteoclast precursors or osteoclasts. Excessive secretion of RANKL causes many bone-related diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis and bone metatsasis of cancer. In a previous study, the scFv antibody 4D3 against RANKL was selected from a human scFv library by phage display. However, it lost binding activity when reformatted to immunoglobulin form and expressed from mammalian cells because it has an N-glycosylation site (NLT) in CDR-H3. In this study, mutants of 4D3 antibody whose N-glycosylation sequence was removed were made by NNK random mutagenesis. Binding specificity of mutant and the parental 4D3 scFv antibodies were examined by ELISA against mouse RANKL. Two clones retaining binding ability of the parental clone were chosen. Variable heavy and light chains of the mutants and the parental clone were cloned into human immunoglobulin gamma-1 expression vector. Binding specificity of anti-RANKL hIgG andibodies were examined by ELISA against mRANKL and hRANKL. It was verified that the parental 4D3 anti-RANKL hIgG lost its binding ability, while the two mutant anti-RANKL hIgGs have binding affinity against both RANKLs. In addition, one of the mutant antibodies showed inhibitory effect on osteoclastogenesis by RANKL. The newly found anti-RANKL hIgG from this study will be characterized in futher in vitro and in vivo experiment and applied for study of therapy for bone-related diseases.