Discovery and production of the bacterial phospholipase A2s in microbial cells

Abstract

Phospholipase A2 is the enzyme that catalyzes cleavage of fatty acids in position two of phospholipids, generating free fatty acids and lysophospholipids. Since the products are widely applied in food and cosmetic industries, I was interested in the production of this enzyme by using microbial cells. The secretory PLA2s (sPLA2s), which are highly active with soybean or egg lecithin, have commonly six to eight disulfide bonds and Ca2+ as a prosthetic group. Thereby, bacterial sPLA2 which contains only two disulfide bridges was targeted for the overproduction. I constructed Pichia pastoris- and Escherichia coli-based microbial cell factory for overproduction of the sPLA2 from Streptomyces violaceoruber. This bacterial sPLA2 was expressed in Pichia pastoris X-33 under the control of AOX1 promotor. The codon optimized PLA2 gene was cloned into pPICZαA, which incorporates Saccharomyces cerevisiae α-mating factor pre-pro leader sequence (α-MF) for extracellular production. In E. coli, wild type sPLA2 was expressed using PelB signal sequence for protein export. In the biotransformation of soybean lecithin by produced form recombinants, 95 % of conversion yield was accomplished in E. coli. In the biotransformation reactions, it was observed that biocatalytic reaction was facilitated in high temperatures. In the aspect of industrial application, there was a need for an engineered biocatalyst which is able to endure high temperature and actively produce fatty acids. Therefore, new PLA2 candidates were explored in the pool of marine microorganisms which are known to be survive in harsh environments. I discovered and expressed new PLA2s in E. coli expression system and SmPLA2 were found to be active in high temperature above 60 oC. Furthermore, to improve insoluble expression of SmPLA2, N-terminal domain, whose role has not been elucidated so far, was mutated. Resulting in soluble expression and no enzyme activity in SmPLA2 variants, it was assumed that N-terminal domain of group XIV PLA2 is not only related to soluble expression but also contributes to catalytic activity PLA2.;포스포라이페이스A2(PLA2)는 인지질의 두 번째 위치에 작용하여 기질을 리소인지질과 지방산으로 가수분해하는 효소이다. 효소의 생성물이 식품과 화장품 산업에서 널리 이용될 수 있으므로, 미생물을 이용한 포스포라이페이스A2의 생산을 연구하였다. 분비형의 PLA2는 콩 또는 달걀 유래의 레시틴에 높은 활성을 보이며, 구조적으로는 6개에서 8개의 이황화결합과 칼슘 이온을 보조 인자로 가지고 있다. 본 연구에서는, 2개의 이황화결합만을 가지고 있는 원핵생물 유래의 PLA2를 생산하였다. 본 연구자는 Pichia pastoris와 대장균을 기반으로 한 효소 생산 시스템을 구축하고, Streptomyces violaceoruber 유래의 분비형 PLA2(SvPLA2)를 생산하였다. P. pastoris X-33를 이용하여 AOX1 프로모터 하에서 SvPLA2를 생산하였으며, 이때 코돈 최적화된 서열의 뉴클레오타이드 서열이 사용되었다. 또한 Saccharomyces cerevisiae 유래의 α-mating factor pre-pro leader sequence (α-MF)를 N-말단에 발현하여 생산된 단백질이 세포 외부로 분비되도록 하였다. 대장균 기반의 SvPLA2 생산 시스템에서는 야생형 SvPLA2 서열이 사용되었으며 PelB signal sequence를 이용하여 세포 외부로의 분비를 유도하였다. 재조합 균주 배양액의 상층액을 사용하여 콩 유래 레시틴을 생물전환한 결과, 대장균 기반의 시스템에서 생산된 단백질에서 95%의 기질 전환율을 보였다. 반응이 고온의 환경에서 이루어질 때 이점이 존재하는데, 효소가 공정에 적용되기 위해서는 고온의 환경에서도 활성을 유지하는 특성이 필수적이다. 그러므로, 척박한 환경에서 생존하고 있는 해양 미생물의 유전체 정보에서 신규 PLA2의 후보를 선정하였다. 신규 효소들은 대장균을 기반으로 생산되었으며, 생물전환 결과 Sciscionella marina 유래의 신규 PLA2(SmPLA2)가 60 oC 이상의 고온에서 활성을 보이는 것을 발견하였다. 그러나 신규 효소들은 SVPLA2에 비해 수용성 발현량이 현저히 낮은 문제점을 보였다. 이를 위해 신규 효소의 homology model을 구축하였으며, 그 결과 SvPLA2와 N-말단의 구조에 차이가 있는 것을 관찰하였다. 일반적으로 단백질의 N-말단은 번역 효율에 영향을 끼친다고 알려져 있고, 이를 바탕으로 단백질의 수용성 발현을 위해 SmPLA2의 N-말단을 SvPLA2의 N-말단으로 대체한 variant를 구축하였다. 그 결과 원핵생물 유래 PLA2의 N-말단 도메인이 단백질이 수용성 발현에 영향을 미침과 동시에, 구축된 variant가 효소 활성을 가지지 않음을 바탕으로 효소 활성과도 관련이 있다고 추측하였다.