Enantiomeric separation of underivatized amino acids using chiral crown ethers

Abstract

아미노산의 키랄 이성질체는 각각의 생물학적 활성에 대해 강조되어왔다. 자연적으로 적은 양으로 존재하는 D-아미노산은 신장 질환이나 신경학적 장애가 있는 환자에게서 관찰되었다는 보고가 있으며, 발효 식품에서 몇몇 D-아미노산이 관찰되는 것으로 알려져 있다. 이렇게 키랄 아미노산을 포함하는 다양한 샘플 중 L-아미노산과 D-아미노산을 구별하기 위해서는 키랄 분리 기술이 필요하다. 본 연구에서는 첫 번째 단계로, 유도체화하지 않은 글리신과 19가지 키랄 아미노산의 거울상 이성질체의 분리를 위해 CE-MS에서 (+)- 및 (-)-(18-크라운-6)-2,3,11,12-테트라카르복실산(18C6H4)의 키랄 선택자로써의 능력을 평가했다. 물 또는 포름산 중, 5-50 mM의 농도로 18C6H4를 함유하는 배경 전해질을 거울상 이성질체 분리를 위해 사용하였다. 물 중, 18C6H4의 농도가 20 mM 이상일 때, 12개의 DL-아미노산이 성공적으로 분리되었다. 대조적으로 알라닌, 라이신, 글루탐산 및 히스티딘은 5-10 mM의 18C6H4 농도에서 부분적으로 분리되었다. 그러나, 시스테인과 라이신, 히스티딘은 포름산 중에서 18C6H4의 농도가 30mM일 때 더 나은 분리된 결과를 확인하였다. 반면에 프롤린과 아스파라긴은 18C6H4를 사용하였을 때 분리되지 않았다. 물 중에서 (+)-18C6H4를 사용한 경우, 세린, 트레오닌 및 메티오닌을 제외하고는 모두 L-아미노산이 D-아미노산보다 빨리 전기적으로 이동하였고, (-)-18C6H4를 사용하는 경우에는 거울상 이성질체의 순서가 역전되었다. 다음 단계에서는 키랄 선택자의 소비를 줄이고, 검출기의 오염을 방지하기 위해 부분 충전 방법으로 유도체화하지 않은 아미노산의 키랄 분리를 위한 분석 시스템을 최적화하였다. 개발된 분석 방법은 세 가지의 식초 샘플에 적용하여 유효성을 검증하였다. 결과적으로 세린, 발린, 이소류신, 류신, 아스파르트산, 메티오닌, 페닐알라닌, 아르기닌 및 티로신의 9개 D-아미노산이 발사믹 식초에서 분리되었고, 세린, 류신, 아스파르트산 및 페닐알라닌의 4개 D-아미노산이 흑초에서 분리되었다. 현미 식초에서는 D-아스파르트산 하나만 함유하고 있었다. D-아미노산의 총 농도는 3개의 식초에서 0.5에서 111.6 μg/mL 범위였다. 검출 및 정량의 한계는 각각 0.07-1.03 및 0.24-3.45 μg/mL 범위였으며, 각각의 재현성은 현미 식초의 경우 0.2-10.2%, 발사믹 식초의 경우 0.8-10.5% 그리고 흑초의 경우 2.2-10.2%로 확인하였다. 또한, 시스테인을 제외한 회수율은 현미 식초 추출물의 경우 80.1-119.9%, 발사믹 식초 추출물은 80.0-119.5%였고, 흑초 추출물의 경우 80.3-119.0%의 범위로 얻었다.;Enantiomers of the amino acids (AAs) differing only in optical properties have been emphasized for their respective biological activity. A few D-AAs have been reported to be observed in patients with kidney disease or neurological dysfunction and some D-AAs have been observed in fermented foods. Accordingly, chiral separation is needed to discriminate D-AAs in the several fields. In this study, as a first step, we demonstrated chiral separation ability of (+)- and (-)-(18-crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid (18C6H4) as chiral selector (CS) for underivatized 20 AAs by CE-MS. Background electrolyte (BGE) containing 18C6H4 in water or formic acid were used for enantiomeric separation at concentrations of 5 to 50 mM. At the concentration of 30 mM or higher 18C6H4, 12 DL-AAs were separated with good peak resolutions. In contrast, alanine, lysine, glutamic acid and histidine were partially separated at low concentrations of 5 to 10 mM 18C6H4 in water, however lysine, histidine and cysteine were separated when the concentration of 18C6H4 was 30mM in formic acid. Whereas two DL-AAs of proline and asparagine were still not separated by using the 18C6H4. In case of (+)-18C6H4 in water, the L-AAs migrated faster than the D-AAs except for serine, threonine and methionine. When using (-)-18C6H4, the order of the enantiomer was reversed. In the next step, in order to reducing the consumption of CS and preventing the contamination of detector, the analytical system for the chiral separation of underivatized AAs was optimized using partial filling method. Finally, this method was validated for applying to three vinegar samples. As a result, 9 D-AAs of serine, valine, isoleucine, leucine, aspartic acid, methionine, phenylalanine, arginine and tyrosine were separated in balsamic vinegar (WV), 4 D-AAs of serine, leucine, aspartic acid and phenylalanine in black vinegar (BV), and D-aspartic acid in grain vinegar (GV). The total concentrations of D-AAs ranged from 0.5 to 111.6 μg/mL in the three vinegars. Calculated limits of detection and quantification ranged from 0.07 to 1.03 and from 0.24 to 3.45 μg/mL, respectively. Each repeatability ranged from 0.2 to 10.2%, from 0.8 to 10.5% and from 2.2 to 10.2%, GV, WV and BV respectively. Also, recoveries except for cysteine ranged from 80.1 to 119.9% for GV extract, form 80.0 to 119.5% for WV extract and from 80.3 to 119.0% for BV extract.