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dc.contributor.advisor박진병-
dc.contributor.author이다솜-
dc.creator이다솜-
dc.date.accessioned2019-05-07T16:30:03Z-
dc.date.available2019-05-07T16:30:03Z-
dc.date.issued2019-
dc.identifier.otherOAK-000000154253-
dc.identifier.urihttp://dcollection.ewha.ac.kr/common/orgView/000000154253en_US
dc.identifier.urihttp://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/249774-
dc.description.abstractAmines are widely used as active ingredients and/or building blocks for the synthesis of antibacterial agents and phenolipids. However, they are difficult to prepare by chemical means. Thereby, I have examined enzyme-based asymmetric synthesis of aliphatic long chain amines (e.g., amino fatty acids) from renewable fatty acids such as ricinoleic acid and oleic acid. Specifically, enzyme cascade reactions for the synthesis of long chain aliphatic amines such as (Z)-12-aminooctadec-9-enoic acid, 10- or 12-aminooctadecanoic acid, and 10-amino-12-hydroxyoctadecanoic acid from renewable fatty acids were investigated. (Z)-12-aminooctadec-9-enoic acid was produced from ricinoleic acid ((Z)-12-hydroxyoctadec-9-enoic acid) via (Z)-12-ketooctadec-9-enoic acid by a two-step biotransformation involving a long chain secondary alcohol dehydrogenase (SADH) from Micrococcus luteus and a variant of the amine transaminase (ATA) from Vibrio fluvialis. 10-Aminooctadecanoic acid was prepared from oleic acid ((Z)-octadec-9-enoic acid) via 10-hydroxyoctadecanoic acid and 10-ketooctadecanoic acid by a three-step biocatalysis reaction involving not only the SADH and ATA variants, but also a fatty acid double bond hydratase (OhyA) from Stenotrophomonas maltophilia. 10-Aminooctadecanoic acid was produced at a total rate of 4.4 U/g dry cells with a conversion of 87% by recombinant Escherichia coli expressing the SADH and ATA variants, and OhyA simultaneously. In addition, bulky aliphatic amines could also be produced by the isolated enzymes (i.e., the SADH, the ATA variants, and a NADH oxidase from Lactobacillus brevis) with methylbenzylamine or benzylamine as amino donor. This study thus contributes to the biosynthesis of long chain aliphatic amines having two large substituents next to the amine functionality. In addition, through the multi-enzyme cascade system (i.e., NADH oxidase (NOX) system, Lactate dehydrogenase (LDH) system, Alanine dehydrogenase (AlaDH) system) based on green organic chemistry it could possible to overcome the limitation of unfavorable reaction equilibrium resulting from asymmetric synthesis from amino acid as amino donor, which can produce over 80% of (Z)-12-aminooctadec-9-enoic acid compared to ricinoleic acid. Furthermore, through the molecular docking study, I have found some new engineering sites that is computationally predicted to exhibit higher enzyme activity than previously used VF-ATA variants considering molecular mechenics (force field) of enzyme-substrates. This study will contribute to the construction of a multi-enzyme cascade reaction systems and the novel VF-ATA variants based on In silico-3DM in order to produce long chain aliphatic amines from renewable fatty acids in the method of green organic chemistry. Keywords: enzyme cascade reactions, long chain aliphatic amines, amine transaminase, whole cell biotransformation, Escherichia coli, enzyme engineering;아민류(Amines)는 최근 식품, 의약, 제약 분야에서 phenolipids 및 항균, 계면 활성의 주요 소재로 널리 이용되고 있다. 구체적으로 산업계에서는 계면활성제, 윤활제의 소재로 이용되고 있고, 의약 및 제약 공업에서는 항암, 항 염증제의 원료로 이용되고 있다. 특히, 아미노 지방산은 양친매성의 구조적 특성으로 인해 생체 이용률을 증가시킴으로써 제약 산업에서 신약 개발의 선구물질로서 이용되고 있다. 그러나, 화학적 합성에 의존하던 기존의 아미노 지방산 합성 방식은 고비용, 장시간의 복잡한 반응 조건으로 인해 효율성과 경제성이 낮을 뿐만 아니라 많은 부산물을 생성한다는 단점이 있다. 이러한 배경 하에서, 본 연구자는 효소적 기반의 비대칭 생합성 방식을 통해 재생 가능한 장쇄/장쇄 수산화 지방산으로부터 유래된 한 예인 올레산 또는 리놀레산으로부터 장쇄 2차 아미노 지방산 형태로 전환시킬 수 있음을 새로이 규명하였다. 구체적으로는, 장쇄/장쇄 수산화 지방산으로부터 효소적 연쇄 반응을 통해 (Z)-12-아미노-옥타데카-9-엔오익 산, 10-아미노옥타데카노익 산, 12-아미노옥타데카노익 산, 10-아미노-12-하이드록시옥타데카노익 산과 같은 아미노지방산을 생성할 수 있음을 확인하였다. 한 실시 예로, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 2차 장쇄 알코올 탈수소화효소 유전자(SADH) 와 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis) 유래의 ω-아미노기 전이효소 유전자(ω-ATA)를 도입한 대장균 BL21(DE3) 균주를 이용하여 리시놀레산으로부터 (Z)-12-케토-옥타데카-9-엔오익 산을 거쳐 2차 아미노 지방산인 (Z)-12-아미노-옥타데카-9-엔오익 산을 생산할 수 있었다. 또 다른 실시 예로는, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소(OhyA) 유전자와 상기의 2차 장쇄 알코올 탈수소화효소 유전자 및 ω-아미노기 전이효소 유전자를 도입한 대장균 BL21(DE3) 균주를 이용하여 올레산으로부터 10-하이드록시-옥타데카노익 산과 10-케토-옥타데카노익 산을 거쳐 10-아미노옥타데카노익 산을 생산할 수 있었다. 그 결과, 올레산으로부터 유래한 장쇄 2차 아미노 지방산인 10-아미노옥타데카노익 산이 4.4 U/g dry cells의 전환 속도와 첨가한 기질대비 87%의 전환 수율을 보이며 성공적으로 생합성 되었다. 뿐만 아니라, 2차 장쇄 알코올 탈수소화효소(SADH), ω-아미노기 전이효소(ω-ATA) 그리고 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 유래의 NADH 산화효소(NOX)와 같은 효소적 연쇄 반응에 관여하는 효소를 정제·분리하고, 여기에 리시놀레산과 알파메틸벤질아민 또는 벤질아민과 같은 산업적 가치가 큰 아미노 공여체로부터 부피가 큰 지방족 아민을 생합성 할 수 있음을 새로이 확인하였다. 따라서, 미생물 또는 효소기반의 연쇄 반응을 통해서 아민 작용기를 중심으로 하여 양 말단에 큰 치환기를 가지는 아미노 지방산을 고농도로 생합성 할 수 있음을 규명하였다. 뿐만 아니라 알코올 탈수소 효소와 변이형의 ω-아미노기 전이효소 그리고 환원적 아민 합성법에 관여하는 추가효소(e.g., NADH 산화효소(NOX), 알라닌 탈수소효소(AlaDH), 젖산 탈수소효소(LDH))를 조합하여 새롭게 구축된 다양한 생물전환 경로를 통해 아민 공여체의 비대칭 합성 부산물에 의한 비 평형 상태를 극복하여 리시놀레산으로부터 80%이상의 전환 수율로 (Z)-12-아미노-옥타데카-9-엔오익 산을 생성할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 기질-효소간의 분자역학에 근거한 in-silico 모델링 시뮬레이션을 통해 기존의 ω-아미노기 전이효소(ω-ATA)보다 높은 활성을 가지는 새로운 효소를 개발하였다. 최종적으로, 본 연구를 통해 그 동안 알려지거나 시도되지 않았던 새로운 효소적 연쇄반응 및 효소 시스템을 구축하여 친환경적이고 산업적으로 우수한 방식으로 장쇄 아미노 지방산을 고농도로 생성할 수 있음을 새로이 규명하고자 한다.-
dc.description.tableofcontentsI. Introduction 1 II. Materials and Methods 9 2.1 Microbial strains and cultivation media 9 2.2 Chemicals and materials 9 2.3 Acetophenone assay 11 2.4 Multi-enzyme cascade reaction of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic acid from Ricinoleic acid 11 2.4.1 Protein Purification 11 2.4.2 NADH oxidase (NOX) system 12 2.4.3 Lactate Dehydrogenase (LDH) system 12 2.4.4 Alanine dehydrogenase (AlaDH) system 12 2.5 Whole-Cell Biotransformations 12 2.6 A direct assay for PLP/PMP using 5-Aminodecanoic acid 13 2.6.1 Biosynthesis of 5-ketodecanoic acid from 5-Hydroxydecanoic acid 13 2.6.2 Chemical synthesis of 5-Aminodecanoic acid 13 2.6.3 UV-visible spectrophotometric assay of 5-Aminodecanoic acid 14 2.7 Product Analysis by Gas Chromato graphy/Mass Spectrometry (GC/MS) 14 2.8 Isolation of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic acid and 10-Aminooctadecanoic acid after Biotransformation 14 2.9 Rational protein design of Vibrio fluvialis Amine transaminase variants 15 2.9.1 Molecular modeling of VF-ATA variants 15 2.9.2 Generation of in silico noble enzyme variants 18 2.9.3 Site-direct mutagenesis of VF-ATA variants (H3_RA) 23 2.9.4 Enzyme purification of VF-ATA variants 26 2.9.5 Protein electrophoresis 26 2.9.6 Biotransformation of novel VF-ATA variants 26 III. Results and discussions 27 3.1.Enzyme Screening for the Synthesis of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid from Ricinoleic Acid 27 3.2 Biotransformation of Ricinoleic Acid into (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid 32 3.3 Biosynthesis of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid with Benzylamine and Alanine as Amino Donor 41 3.4 Whole-cell Biotransformation of Ricinoleic Acid into (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid 45 3.5 Biotransformation of Other Hydroxy Fatty Acids 49 3.6 Biosynthesis of 10-Aminooctadecanoic Acid from Oleic Acid 53 3.7 A direct assay for PLP/PMP using 5-Aminodecanoic acid 58 3.8 Rational protein design of Vibrio fluvialis Amine transaminase variants for Asymmetric Synthesis of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid 65 3.8.1 Molecular docking simulation of VF-ATA variants 65 3.8.2 Rational protein design for in silico based novel VF-ATA variants 68 3.8.3 Site-direct mutagenesis of VF-ATA variants (H3_RA) 72 3.8.4 Asymmetric Synthesis of (Z)-12-Aminooctadec-9-enoic Acid using novel VF-ATA 75 3.9 Comparison with Chemical Procedure 85 IV. Conclusions 87 V. Reference 88 Abstract in Korean 93-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent3111814 bytes-
dc.languageeng-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.subject.ddc600-
dc.titleEnzyme Cascade Reactions for the Biosynthesis of Long Chain Aliphatic Amines from Renewable Fatty Acids-
dc.typeMaster's Thesis-
dc.format.pageix, 95 p.-
dc.identifier.thesisdegreeMaster-
dc.identifier.major대학원 식품공학과-
dc.date.awarded2019. 2-
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일반대학원 > 식품공학과 > Theses_Master
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