Molecular mechanism of chemoresistance and restoration in human gastric cancer cells

Abstract

Gastric cancer is characterized by a high rate of relapse and failure of chemotherapy because of the emergence of drug resistant cells. Hence, resistance to chemotherapy is a major obstacle for the management of gastric cancer. It might be related with the development of cancer stem cells (CSCs). The aim of this study is to investigate the characteristics of the 5-fluorouracil (FU) resistant gastric cancer and to study how to restore the chemosensitivity. First, 5-FU-resistant gastric cancer cell, AGS-R was established by continuous exposure to 5-FU with gradual increase of its concentration for about 1 year. Comparing with AGS, thymidylate synthase (TS) expression in AGS-R was highly increase at transcriptional and translational level. And decreased transcriptional activity of β-catenin in AGS-R was confirmed by Western blotting and luciferase assay. Even though treatment with ICG-001, an inhibitor of β-catenin, showed growth inhibition of AGS in a dose- and time-dependent manner, but it could not in AGS-R. The expression of CD44, well-known CSCs marker, was significantly higher on AGS-R compared to AGS. And the Notch pathway was remarkably up-regulated. Flow cytometry analysis revealed that CD44 expression was reduced on AGS-R transfected with specific siRNA for notch intracellular domain (NICD). In conclusion, this study suggests that chemoresistance of gastric cancer against continuous exposure to 5-FU is associated with decrease of β-catenin activity and development of stemness via the activation of Notch pathway. Therefore, the inhibition of Notch pathway might be a potential therapeutic target in 5-FU-resistant gastric cancer.;위암은 우리나라에서 가장 빈발하는 암 중 하나이지만 항암제 내성으로 인해 수술 후에도 보조항암화학요법 치료에도 불구하고 재발률이 높고 고식적 항암화학요법의 효과 역시 제한적이다. 항암제 내성은 암치료에서 가장 큰 장애물 중 하나이기 때문에 이것을 극복하기 위하여 많은 연구가 진행되었고, 비정상적인 줄기세포가 위계적으로 관여한다는 암줄기세포 이론이 대두되었으며 이것이 항암제 내성에 관여한다는 것을 증명하는 여러 연구들이 보고되었다. 위암줄기세포 역시도 현재 활발히 연구 중에 있으며, 이는 약물 저항성을 극복하기 위한 새로운 표적치료 개발에 중요한 역할을 담당할 수 있다. 본 연구에서는 위암에서 사용되는 5-에프유에 저항성을 가지는 세포에서의 특징을 살펴보고, 항암에 대한 저항성 기전을 연구하고자 하였다. 이를 위해 기존의 다른 연구에서 보고된 바와 같이, 위암세포주 (AGS)를 5-에프유 저농도에서 단계적으로 농도를 증가시키며 1년 동안 장기간 노출된 상태로 계대 배양하여 5-에프유 저항성 위암세포주를 획득하였다. 5-에프유에 대한 저항성을 획득한 세포는 모세포에 비해 5-에프유에 대한 감수성이 감소하고, thymidylate synthase 단백질과 mRNA 발현이 증가하는 것을 통해 항암저항성을 확인하였다. 5-에프유 저항성 위암세포주는 모세포와 비교하여 β-catenin의 전사 활성이 감소 함을 확인 하였으며, β-catenin의 억제제인 ICG-001으로 처리하면 모세포는 세포 성장 억제되었으나 5-에프유 저항성 위암세포주는 성장이 억제되지 않는 것을 확인하였다. 이와 더불어 암세포줄기 표지자로 알려진 CD44의 발현이 모세포에 비해 5-에프유 저항성 위암세포주에서 유의하게 높다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 얻게 된 기전을 연구하기 위하여 위암줄기세포와 관련이 있는 것으로 알려진 다른 신호전달경로 (Notch, Hedgehog, STAT) 단백질의 발현 정도를 모세포와 5-에프유 저항성 위암세포주에서 비교해보았다. 항암저항성 위암세포주에서 단백질 중 Notch1 발현이 모세포에 비하여 현저하게 증가하였으며 이를 통해 Notch 신호전달경로가 활성화되어 있음을 확인하였다. 이 결과를 토대로 Notch 신호전달경로가 CD44 증가에 영향을 주었는지 확인하고자 5-에프유 저항성 위암세포주를Notch-1 siRNA를 이용하여 knockdown시켜 형질전환을 유도하였으며, 형질 전환된 세포주에서 CD44 발현이 감소됨을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구를 통해 5-에프유 저항성 위암세포주에서 CD44 발현이 증가되었고, β-catenin의 단백 발현과 전사 활성이 감소된 반면 Notch 신호전달경로가 현저히 활성화 되었고, 이 경로를 통해 CD44 발현에 영향을 주는 것을 확인함으로써 Notch 신호전달경로의 활성화는 위암의 항암저항성에 중요한 역할을 한다는 것을 제시하였다.