View : 194 Download: 0

The Efficacy of Conditioned Medium Released by Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells in a Chronic Murine Colitis Model

Title
The Efficacy of Conditioned Medium Released by Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells in a Chronic Murine Colitis Model
Other Titles
만성장염 동물모델에서 편도유래 중간엽 줄기세포를 배양한 배지의 효과
Authors
이고은
Issue Date
2018
Department/Major
대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
정성애
Abstract
Background: Tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSC) have characteristics of MSC and have many advantages. TMSC are easily acquired from tonsillectomy in children, and features short doubling time, high differentiation capacity, and immune modulatory activity. In our previous studies, intraperitoneal injection of TMSC in acute and chronic colitis mouse models has demonstrated improvements in the disease activity index, colon length, and the expression levels of pro-inflammatory cytokines. However, TMSC did not show significant evidence of migration to the inflammation site of intestine. The aim of this study was to verify the therapeutic effect of conditioned medium released by TMSC (TMSC-CM) in a mouse model of DSS-induced chronic colitis. Methods: TMSC were acquired from palatine tonsil tissue after tonsillectomy surgery, with informed consent. TMSC-CM was used after seeding 5×105 cells onto a 100 mm dish and culturing for 5–7 days; the TMSC-CM-concentrate (conc) was concentrated by 3 times using a 100 kDa cut-off centrifugal filter. For in vitro study, the immunosuppressive effects of TMSC-CM were confirmed by splenocyte immunosuppression assay. The splenocytes of C57BL/6 mouse were stimulated with mitogens including lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)/ionomycin, and then co-cultured with TMSC or cultured in TMSC-CM. The proliferation of splenocytes was evaluated using the CCK-8 kit. For in vivo study, seven-week-old C57BL/6 mice were randomly assigned into 5 groups: 1) the normal, 2) colitis, 3) TMSC, 4) TMSC-CM, and 5) TMSC-CM-conc groups. Chronic colitis was induced by oral administration of 1.5% DSS for continuous 5 days, followed by 5 additional days of tap water feeding; this cycle was repeated two more times (a total of 30 days). PBS (500 μL), TMSC (1×10⁶ cells/500 μL), TMSC-CM (500 μL), and TMSC-CM-conc (500 μL) were injected via intraperitoneal route 4, 4, 12, and 4 times, respectively. The severity of colitis was assessed by measuring their disease activity index (DAI), body weight change, colon length, histologic grading, and the expression levels of cytokines. Results: The splenocytes showed decreased proliferation when co-cultured with TMSC, and cultured in TMSC-CM. Proliferation was significantly reduced by the number of TMSC and the concentration of TMSC-CM. In the treatment groups in which TMSC, TMSC-CM, or TMSC-CM-conc was administered, reduction of DAI, weight gain, recovery of colon length, and decrease in the expression level of the proinflammatory cytokines, interleukin (IL)-1β, IL-6, and IL-17 were observed at day 30, compared to the colitis group. However, histologic colitis scoring and the expression level of tumor necrosis factor α (TNFα) and IL-10 between each group did not show a significant difference. Conclusion: TMSC-CM showed equivalent effect to TMSC on the improvement of inflammation in a DSS-induced chronic colitis mouse model. Therefore, we suggest applying TMSC-CM for the treatment of inflammatory bowel disease without any cell transplantation.;서론: 편도유래 중간엽 줄기세포는 편도절제술을 통해 버려지는 조직에서 쉽게 얻을 수 있으며, 분화하는데 시간이 적게 걸리고 분화능이 좋다는 장점이 있다. 이전 연구에서 DSS (dextran sulfate sodium)로 유도한 급성 및 만성장염 동물모델에서 편도유래 중간엽 줄기세포를 복강내 주입하였을 때 장염이 호전되었으나, 줄기세포가 염증이 있는 장으로 직접 이동하지는 않는 것이 관찰되었다. 본 연구에서는 만성장염 동물모델에서 편도유래 중간엽 줄기세포를 배양한 배지의 효과에 대해서 알아보고자 한다. 방법: 환자의 사전 동의를 통해 편도절제술 후의 구개편도 조직에서 편도유래 중간엽 줄기세포를 얻었다. 5×105개의 편도유래 중간엽 줄기세포를 5-7일간 배양한 배지와 100 kDa 차단 여과필터를 사용해 3배 농축한 배지를 실험에 이용하였다. 생체 외 실험으로 비장세포를 이용하여 편도유래 중간엽 줄기세포 및 이를 배양한 배지의 면역억제 효과에 대해서 알아보았다. 동물 실험으로는 7주령의 C57BL/6 마우스를 정상군, 장염군, 편도유래 중간엽 줄기세포 투여군, 편도유래 중간엽 줄기세포를 배양한 배지 투여군, 농축한 배지 투여군 이렇게 5개의 군으로 무작위 배정하여 실험을 진행하였다. 만성장염은 1.5% DSS 5일 투여 후 물 5일 투여하는 과정을 3번 반복하여 총 30일에 걸쳐 유도하였고, 장염 대조군에는 PBS 4회, 편도유래 중간엽 줄기세포군에는 1×106 cells/500 μL, 편도유래 중간엽 줄기세포를 배양한 배지군에는 배지 500 μL, 농축한 배지 투여군에는 3배 농축한 배지 500 μL를 복강 내 투여하였다. 장염의 중증도는 질병활성도, 체중의 변화, 장의 길이, 조직학적 변화, 사이토카인 수치를 측정하여 비교하였다. 결과: 생체외 실험에서, 자극된 비장세포는 편도유래 중간엽 줄기세포나 이를 배양한 배지와 함께 배양하였을 때 유의하게 증식이 감소하는 결과를 보였고 세포수와 농도가 증가할수록 더 감소하는 경향을 보였다. 동물 실험에서, 편도유래 중간엽 줄기세포, 이를 배양한 배지, 또는 농축된 배지를 투여한 치료군들은 모두 장염 대조군에 비해 실험 30일째의 질병활성도, 체중의 감소, 장길이의 회복이 유의하게 개선되었으며, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-17의 발현도 감소하였다. 하지만 장의 조직학적 장염 점수, TNFα와 IL-10의 발현은 장염 대조군과 치료군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 결론: DSS로 유도한 만성장염 동물모델에서 편도유래 중간엽 줄기세포와 이를 배양한 배지는 염증 개선에 있어서 동등한 효과를 나타내었다. 따라서 염증성장질환에서 세포를 직접 이식하는 대신 간단하게 배지만을 이용하여 치료하는 방법을 적용해볼 수 있을 것으로 생각한다.
Fulltext
Show the fulltext
Appears in Collections:
일반대학원 > 의학과 > Theses_Ph.D
Files in This Item:
There are no files associated with this item.
Export
RIS (EndNote)
XLS (Excel)
XML


qrcode

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

BROWSE